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Las células cancerosas han desarrollado varios mecanismos para superar el estrés celular y continuar progresando.La proteína quinasa R (PKR) y su proteína activadora (PACT) son los respondedores iniciales que monitorean varias señales de estrés que conducen a la inhibición de la proliferación celular y la apoptosis.Sin embargo, la regulación de la vía PACT-PKR en las células cancerosas sigue siendo en gran parte desconocida.Aquí, encontramos que el ARN no codificante largo (lncRNA) aspartil tRNA sintetasa RNA antisentido 1 (DARS-AS1) está directamente involucrado en la inhibición de la vía PACT-PKR y promueve la proliferación de células cancerosas.Usando la detección funcional a gran escala de lncRNA asociado con el cáncer CRISPRi 971, encontramos que DARS-AS1 se asoció con una proliferación de células cancerosas significativamente mejorada.Por lo tanto, la inactivación de DARS-AS1 inhibe la proliferación celular y promueve la apoptosis de células cancerosas en varias líneas de células cancerosas in vitro y reduce significativamente el crecimiento tumoral in vivo.Mecánicamente, DARS-AS1 se une directamente al dominio de activación de PACT y previene la interacción de PACT-PKR, lo que reduce la activación de PKR, la fosforilación de eIF2α e inhibe la muerte celular apoptótica.Clínicamente, DARS-AS1 se expresa ampliamente en múltiples cánceres, y la sobreexpresión de este lncRNA es indicativa de un mal pronóstico.Este estudio aclara la regulación específica del cáncer de la vía PACT-PKR por DARS-AS1 lncRNA y proporciona otro objetivo para el pronóstico y el tratamiento del cáncer.
La capacidad de adaptarse al estrés es una característica importante de la supervivencia y proliferación de las células cancerosas.La rápida proliferación y las características metabólicas del cáncer alcanzan su punto máximo en microambientes hostiles (privación de nutrientes, hipoxia y pH bajo) que pueden desencadenar vías de señalización de muerte celular.La desregulación de genes sensibles al estrés como p535, proteínas de choque térmico 6, 7, KRAS8, 9 y HIF-110, 11, 12, 13 se observa con frecuencia en el cáncer, lo que bloquea la apoptosis y promueve la supervivencia.
La proteína quinasa R (PKR) es un importante sensor de estrés y una subunidad quinasa del factor de iniciación eucariótico 2α (eIF2α), un regulador de la traducción que vincula el estrés celular con la muerte celular.PKR se identificó originalmente como una proteína antiviral mediante la detección de un ARN extraño de doble cadena (dsRNA).Tras la activación, PKR fosforila eIF2α para inhibir la síntesis de proteínas virales y celulares14,15,16.PACT (proteína activadora de PKR) se ha identificado como la primera proteína activadora de PKR en ausencia de dsRNA17,18,19,20,21,22,23.A través de la interacción directa con PKR, PACT transduce varios estreses (falta de suero, tratamiento con peróxido o arsenito) a PKR y vías de señalización aguas abajo.Además de la fosforilación de eIF2α, la activación de PKR mediada por PACT desencadena varios eventos asociados con la respuesta al estrés, incluido el estado redox alterado a través de la vía PI3K/Akt24, control mejorado de daños en el ADN a través de p5325,26 y NF-κB27,28 Regula la transcripción, 29. Dada su función crítica en la respuesta al estrés, la proliferación, la apoptosis y otros procesos celulares clave, PKR y PACT son dianas terapéuticas prometedoras para muchas enfermedades, especialmente el cáncer30,31,32,33.Sin embargo, a pesar de esta importancia funcional y biológica pleiotrópica, la regulación de la actividad de PACT/PKR en las células cancerosas sigue siendo difícil de alcanzar.
Los lncRNA son transcritos de más de 200 nucleótidos sin potencial de codificación de proteínas.Dado que los proyectos de secuenciación del genoma completo de vanguardia han identificado miles de lncRNA,35,36 se ha hecho un gran esfuerzo para dilucidar sus funciones biológicas.Un creciente cuerpo de investigación ha demostrado que los lncRNA están involucrados en muchos procesos biológicos37, incluida la regulación de la inactivación del cromosoma X38,39, la impronta40, la transcripción41,42, la traducción43 e incluso el crecimiento del cáncer44,45,46,47.Estos estudios informaron que muchos lncRNA están involucrados en la vía PACT/PKR.Uno de esos estudios mostró que lncRNA ASPACT inhibía la transcripción de PACT y aumentaba la retención nuclear del ARNm de PACT.Otros estudios han demostrado que el lncRNA nc886 se une a PKR e inhibe su fosforilación49,50.Hasta el momento, no se ha informado que el lncRNA regule la activación de PKR mediada por PACT.
El ARN antisentido 1 de aspartil-tRNA sintetasa (DARS-AS1) ha sido identificado como un lncRNA oncogénico51,52,53,54.A través de la regulación de miP-194-5p53, miP-12952 y miP-532-3p51, se ha demostrado que DARS-AS1 promueve el crecimiento de carcinoma de células renales de células claras, carcinoma de tiroides y carcinoma de pulmón de células no pequeñas, respectivamente.Tong y sus colegas también encontraron que DARS-AS1 promueve la progresión del mieloma al mantener la estabilidad del motivo de unión al ARN de la proteína 39 (RBM39).Sin embargo, no se han realizado estudios sobre si este lncRNA está involucrado en la regulación de la activación de PACT-PKR y la respuesta al estrés de las células cancerosas.
Aquí, realizamos una pantalla de pérdida de función a gran escala utilizando el sistema CRISPRi y determinamos que DARS-AS1 lncRNA promueve la proliferación de varios tipos de células cancerosas.Además, hemos identificado un mecanismo principal: DARS-AS1 se une directamente a PACT, inhibe la unión de PACT y PKR, previene la fosforilación de eIF2α, un sustrato de PKR más bajo y, en última instancia, inhibe la muerte celular apoptótica.En conclusión, nuestro trabajo revela que el lncRNA de DARS-AS1 es un regulador de la vía PACT-PKR y un objetivo potencial para el tratamiento y el pronóstico del cáncer.
Amplios estudios de perfiles genómicos han identificado cientos de lncRNA asociados con el cáncer.Sin embargo, su función sigue siendo en gran parte desconocida56.Para identificar candidatos prometedores de lncRNA involucrados en la progresión del cáncer, realizamos una pantalla de pérdida de función para reducir la proliferación en la línea celular de cáncer colorrectal SW620 utilizando el sistema CRISPRi (Fig. 1a).La característica única de las líneas celulares de cáncer de colon SW480 y SW620 es que se derivan de tumores primarios y secundarios en un solo paciente.Esto proporciona una valiosa comparación para estudiar los cambios genéticos en la progresión del cáncer de colon avanzado.Por lo tanto, analizamos los transcriptomas de líneas celulares de cáncer colorrectal (SW480 y SW620) mediante secuenciación de ARN y recopilamos algunos lncRNA funcionales potenciales de la literatura publicada.Con base en estos resultados, diseñamos una biblioteca de sgRNA agrupada que contiene 7355 oligos de sgRNA dirigidos a 971 lncRNA asociados con el cáncer y 500 oligos de sgRNA no dirigidos para un control negativo (Datos complementarios 1).
Representación esquemática del cribado mediante el sistema CRISPRi.b Enriquecimiento de sgRNA después de la selección.La línea punteada horizontal representa log2 (cambio de veces) = ±0,58.La línea punteada vertical indica un valor de p = 0,05.Los puntos negros representan sgRNA no objetivo (designado como NC).Los puntos rojos son sgRNA dirigidos a DARS-AS1.Los puntos azules son sgRNA dirigidos a LINC00205, un lncRNA oncogénico descrito anteriormente.cambio de pliegue = (lectura normalizada, día 17)/(lectura normalizada, día 0).c La eliminación de DARS-AS1 sgRNA inhibió el crecimiento celular.Las barras de error representan ± la desviación estándar de los tres experimentos.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 prueba t de Student de dos colas.d Expresión de DARS-AS1 en tumores (conjunto de datos TCGA).em Expresión de DARS-AS1 en muestras emparejadas normales y tumorales de pacientes con BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP y COAD, respectivamente (conjunto de datos TCGA).Los valores de p se obtuvieron utilizando la prueba t de Student de dos colas pareadas.
Después de construir el plásmido y empaquetar el lentivirus, transducimos la línea celular de cáncer colorrectal dCas9-SW620 con la biblioteca anterior en cuatro experimentos de infección independientes.La multiplicidad de infección (MOI) para estas infecciones fue de 0,1 a 0,3, lo que indica que cada célula solo puede transfectarse con un sgRNA.Después de 18 días de cultivo in vitro, el perfil de enriquecimiento de los sgRNA objetivo disminuyó o aumentó después de la selección, mientras que la cantidad de oligonucleótidos de control no dirigidos se mantuvo relativamente sin cambios en comparación con el perfil de preselección, lo que indica que nuestro objetivo tiene una alta especificidad de detección. biblioteca.Arroz.1b y cuadro complementario 1). LINC00205, que previamente se informó que promueve el cáncer de pulmón y la progresión del cáncer de hígado58,59,60, se descartó (log2 (cambio de veces) < −0,58, valor de p < 0,05), lo que confirma la confiabilidad de esta detección (Fig. 1b). LINC00205, que previamente se informó que promueve el cáncer de pulmón y la progresión del cáncer de hígado58,59,60, se descartó (log2 (cambio de veces) < −0,58, valor de p < 0,05), lo que confirma la confiabilidad de esta detección (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Se excluyó LINC00205, que anteriormente se informó que promueve la progresión del cáncer de pulmón y el cáncer de hígado58,59,60 (log2 (cambio de veces) <-0,58, valor de p <0,05), lo que confirma la solidez de esta evaluación (Fig. 1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （（LOG2 （倍数 变化） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1B）。。。。。。。。。。。。。 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （（LOG2 （倍数 变化） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1B）。。。。。。。。。。。。。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Se excluyó LINC00205, que anteriormente se informó que promueve la progresión del cáncer de pulmón e hígado58,59,60 (log2 (cambio de veces) <-0,58, valor de p <0,05), lo que confirma la solidez de esta evaluación (Fig. 1b).
Entre todos los lncRNA probados, también se examinó DARS-AS1, con los tres oligonucleótidos de sgRNA afines reducidos significativamente después de 18 días de cultivo, lo que sugiere que la eliminación de este lncRNA resultó en una reducción de la proliferación del cáncer (Fig. 1b).Este resultado fue respaldado aún más por el análisis MTS en células de cáncer colorrectal que mostró que la tasa de crecimiento de las células silenciadas DARS-AS1 solo se redujo a la mitad en comparación con las células de control (Figura 1c) y fue consistente con informes anteriores de varios otros tipos de cáncer.: cáncer de riñón de células claras, cáncer de tiroides y cáncer de pulmón de células no pequeñas51,52,53,55.Sin embargo, su función y mecanismos moleculares en el cáncer colorrectal siguen sin explorarse.Por lo tanto, elegimos este lncRNA para un estudio adicional.
Para estudiar la expresión de DARS-AS1 en pacientes, analizamos exhaustivamente 10 327 muestras de tumores del proyecto Cancer Genome Atlas (TCGA).Nuestros resultados muestran que DARS-AS1 se expresa ampliamente y se regula significativamente en células sanas en una variedad de tumores, incluido el adenocarcinoma de colon (COAD), el carcinoma renal de células claras (KIRC) y el carcinoma renal de células papilares (KIRP)..Muy pocos (Fig. 1d y Suplementario Fig. 1a, b). El análisis de muestras pareadas sanas/tumorales confirmó además una expresión significativamente mayor de DARS-AS1 en los tumores de carcinoma urotelial de vejiga (BLCA), carcinoma renal de células claras renales (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD), carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) , carcinoma de endometrio del cuerpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma hepatocelular de hígado (LIHC), carcinoma de células papilares de riñón y riñón (KIRP) y adenocarcinoma de colon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e-m) . El análisis de muestras pareadas sanas/tumorales confirmó además una expresión significativamente mayor de DARS-AS1 en los tumores de carcinoma urotelial de vejiga (BLCA), carcinoma renal de células claras renales (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD), carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) , carcinoma de endometrio del cuerpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma hepatocelular de hígado (LIHC), carcinoma de células papilares de riñón y riñón (KIRP) y adenocarcinoma de colon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e-m) .El análisis de muestras pareadas sanas/tumorales también confirmó una expresión significativamente mayor de DARS-AS1 en carcinoma urotelial de vejiga (BLCA), carcinoma renal de células claras y carcinoma de células renales (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD) y tumores de carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) , carcinoma de endometrio del cuerpo del útero (UCEC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma hepatocelular de hígado (LIHC), carcinoma de células papilares de riñón (KIRP) y adenocarcinoma de colon (COAD) (valor de p < 0,05) (Fig. 1e–m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA) 、 肾 透明 细胞癌 细胞癌 (KIRC) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（）） ， 肺腺癌 （Luad） ， 肝肝 （（lihc） ， 肾 肾 细胞癌 （kirp） 和结肠腺癌 （coad） p 值<0.05） (图1e-m) .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 DARS-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 （（（） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （（（肾 肾 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞癌 (kirp) (coad) (p 值<0.05) (图1e-m) .El análisis de muestras pareadas sanas/tumorales apoyó aún más el papel de DARS-AS1 en los tumores de carcinoma urotelial de vejiga (BLCA), carcinoma de células renales de células claras (KIRC), adenocarcinoma de próstata (PRAD) y carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -metro). expresión en carcinoma de cuerpo uterino (UCEC), adenocarcinoma de pulmón (LUAD), carcinoma hepatocelular (LIHC), carcinoma de células papilares renales (KIRP) y adenocarcinoma de colon (COAD) (valor de p <0,05) (Figura 1e -m).Tomados en conjunto, estos resultados indican que DARS-AS1 se expresa amplia y altamente en una variedad de cánceres.
Debido a que DARS-AS1 y DARS (el gen que codifica la hebra antisentido) comparten el mismo promotor y están ubicados uno al lado del otro, diseñamos shRNA para eliminar específicamente DARS-AS1 pero no DARS (Figura complementaria 2a,b y Tabla complementaria 2) .Además de SW620, también usamos otras tres líneas celulares que expresan DARS-AS1 para estudiar la eficacia y la función de la eliminación de shRNA (Tabla complementaria 3).Nuestros resultados indicaron que los tres shRNA desarrollados lograron al menos un 80% de eficiencia de eliminación de DARS-AS1 con poco efecto en la cantidad de mRNA de DARS (Fig. 2c-f complementaria).Además, encontramos que la eliminación de DARS-AS1 con estos shRNA inhibió significativamente el crecimiento celular en las líneas celulares de cáncer colorrectal SW620 (49,7 %) y HCT116 (27,7 %), la línea celular de cáncer de mama MBA-MD-231 (53,4 %).) y la línea celular de hepatoma HepG2 (92,7 % de reducción), así como su capacidad para formar esferas no ancladas (reducción promedio de ~50,8 %, 44,6 %, 40,7 % y 75,7 % por línea celular) (Fig. 2a,b).En SW620, los resultados del ensayo de formación de colonias confirmaron además que el shRNA de DARS-AS1 inhibía significativamente la proliferación celular con una disminución promedio de aproximadamente el 69,6 % (Fig. 2c).
Efecto del shRNA de control y el shRNA de DARS-AS1 sobre la proliferación celular (a) y la formación de esferoides (b) en células SW620, HCT116, MBA-MD-231 y HepG2.c Efecto del shRNA de control y el shRNA de DARS-AS1 en la formación de colonias en células SW620.Proliferación celular (d), formación de esferoides (e) y formación de colonias (f) de células SW620 que sobreexpresan DARS-AS1.Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de tres experimentos.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 y *** p ≤ 0,001 mediante la prueba t de Student de dos colas.
Para complementar los estudios de pérdida de función, luego creamos células SW620 que sobreexpresan DARS-AS1 (Fig. 2g complementaria).La sobreexpresión de DARS-AS1 aumentó significativamente el crecimiento celular (1,8 veces), la formación de esferoides no anclados (1,4 veces) y la formación de colonias (3,3 veces) en células SW620 (Fig. 2d-f).Confirmamos este resultado utilizando otra línea celular que expresa DARS-AS1, A549.Esta proliferación celular mejorada debido a la sobreexpresión de DARS-AS1 se observó adicionalmente en las células A549 (Figura complementaria 2h, i y Tabla complementaria 3).En conjunto, estos estudios de ganancias y pérdidas demuestran que DARS-AS1 promueve la proliferación de células cancerosas in vitro.
Para explorar el mecanismo subyacente por el cual DARS-AS1 regula la proliferación celular, realizamos un análisis desplegable de ARN para identificar a sus posibles socios de unión a proteínas.Los resultados de RT-qPCR mostraron que aproximadamente el 86,2 % de DARS-AS1 se encuentra en el citoplasma de las células SW620 (Fig. 3a complementaria).El DARS-AS1 o pseudoARN biotinilado transcrito in vitro se incubó luego con lisados ​​de células SW620 seguido de separación por SDS-PAGE.La tinción con plata posterior mostró que una banda distinta (~ 38 kDa) se enriqueció significativamente en las muestras extraídas de DARS-AS1, pero no en las muestras ficticias de ARN o perlas (Fig. 3a).Esta banda se identificó como una proteína activadora de PKR (PACT) mediante espectrometría de masas (MS) y se confirmó mediante inmunotransferencia en las líneas celulares SW620, HCT116 y HepG2 (Fig. 3a,b).El enriquecimiento de DARS y proteínas PACT relacionadas (PKR y TRBP) también se investigó mediante análisis de ARN mediante transferencia Western (WB).Los resultados indicaron que no se encontró una interacción directa entre el ARN de DARS-AS1 y estas tres proteínas (Fig. 3b complementaria).La interacción específica entre DARS-AS1 y PACT se confirmó aún más mediante el análisis de inmunoprecipitación de ARN (RIP), que mostró que DARS-AS1 estaba significativamente enriquecido en anticuerpos anti-PACT pero no en otros ARN de control (Figura 3c).Para determinar si DARS-AS1 interactúa directamente con PACT en ausencia de cualquier otro componente celular, se realizó un ensayo de interferometría de biocapa (BLI) in vitro usando PACT purificado.DARS-AS1 marcado con biotina o ARN ficticio se inmovilizó en biosensores de estreptavidina (SA) y luego se incubó en tampón cinético que contenía PACT 1 μM.En particular, PACT se unió fuertemente a DARS-AS1 (valor KD ~ 26.9 nM), pero no para imitar el ARN (Figura 3d).En conjunto, estos resultados demuestran una interacción directa y una alta afinidad entre DARS-AS1 y PACT.
El análisis de extracción de ARN identificó la interacción de DARS-AS1 con PACT en células SW620.Arriba, tinción con plata de proteínas relacionadas.Se realizaron inmunotransferencias inferiores con anticuerpo anti-PACT.b El análisis desplegable de ARN se realizó en células HCT116 (arriba) y HepG2 (abajo).El enriquecimiento de PACT se detectó mediante inmunotransferencia.Los ensayos de inmunoprecipitación de cRNA (RIP) se realizaron en células SW620 usando los anticuerpos indicados.d Las curvas de unión de PACT a DARS-AS1 de longitud completa o al ARN de control se obtuvieron mediante interferometría de biocapa (BLI).El ARN se inmovilizó en un biosensor de estreptavidina.Se usó PACT 1 µM para medir la asociación.El ensayo de extracción de ARN se realizó utilizando DARS-AS1 biotinilado de longitud completa o truncado (arriba).Inmunotransferencia que muestra PACT recibido (abajo).f El PACT marcado purificado se incubó con DARS-AS1 de longitud completa biotinilado o truncado (como en e) para el ensayo RIP in vitro.El ARN extraído se verificó mediante RT-qPCR.g La afinidad relativa de diferentes fragmentos de ARN por PACT se obtuvo mediante interferometría de biocapa.Para el análisis, se utilizaron ARN 100 nM y RAST 1 μM.h Los ensayos de RIP in vitro se realizaron usando PACT intacto purificado o marcado truncado.El ARN extraído se verificó mediante RT-qPCR.i Tasa de crecimiento de células SW620 que sobreexpresan DARS-AS1, PACT o ambos.j La sobreexpresión de DARS-AS1 completo o truncado en células SW620 tuvo diferentes efectos en el crecimiento celular.k La apoptosis se detectó mediante inmunotransferencia con anticuerpo anti-PARP.l La eliminación de DARS-AS1 induce la apoptosis de las células SW620 como se muestra en la citometría de flujo.Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de tres experimentos. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, mediante la prueba t de Student de dos colas. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, mediante la prueba t de Student de dos colas. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 mediante la prueba t de Student de dos colas. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 mediante la prueba t de Student de dos colas.
Luego generamos tres fragmentos de ARN DARS-AS1 biotinilados mediante transcripción in vitro para identificar la región DARS-AS1 requerida para la asociación PACT (Figura 3e).Los resultados del análisis de ARN mostraron que cada fragmento podía interactuar con PACT, pero la región terminal 3' (384 a 768 nucleótidos etiquetados como A3) mostró más de 1 a 384 nucleótidos etiquetados como A1) (Fig. 3e).Se observaron resultados similares en el ensayo RIP in vitro usando PACT recombinante (Figura 3f).De acuerdo con estos resultados, los experimentos para unir fragmentos de ARN inmovilizados a PACT usando BLI también mostraron que PACT tiene una mayor afinidad por A3 (384–768 nt) (valor KD de aproximadamente 94,6 nM), mientras que casi no hay vínculos con otras áreas.(Figura 3d).
También examinamos las regiones de unión asociadas en PACT.PACT contiene tres dominios funcionales, dos de los cuales son dominios de unión a ARN de doble cadena conservados (dsRBD) y un tercer dominio (designado D3) que actúa como activador de las interacciones entre proteínas.Para examinar la capacidad de unión de lncRNA de cada dominio, diseñamos tres mutaciones que eliminaron cada uno de los tres dominios y realizamos un ensayo RIP in vitro.Nuestros resultados mostraron que la eliminación del tercer dominio (D3) de PACT redujo significativamente su interacción con DARS-AS1 (en 0,11 veces en comparación con PACT intacto) en comparación con las otras dos mutaciones (Fig. 3h), se demostró que la liberación de D3 interactuó con DARS.-AC1.En conjunto, estos resultados sugieren que la interacción entre DARS-AS1 y PACT puede ocurrir principalmente a través del extremo 3 'de DARS-AS1 y el dominio D3 de PACT.
Notamos que DARS-AS1 no tuvo efecto en la expresión de PACT y PACT no tuvo efecto en DARS-AS1 (Fig. 3c complementaria).Luego examinamos el efecto de la eliminación de PACT en el crecimiento celular.En contraste con DARS-AS1, las células relativas crecieron de 1,5 a 3 veces más rápido cuando se eliminó PACT (Fig. 3d complementaria).Los resultados del ensayo de formación de colonias indicaron que las células formaron colonias de 2 a 3 veces después del tratamiento con shRNA con PACT (Fig. 3e complementaria).Para probar si DARS-AS1 regula la proliferación celular a través de PACT, generamos células SW620 que sobreexpresan PACT, DARS-AS1 o ambos.La sobreexpresión de PACT mostró una inhibición significativa de la proliferación celular (Figura 3i).Si bien la sobreexpresión de DARS-AS1 per se promovió significativamente la proliferación celular, no hubo una diferencia significativa en la tasa de crecimiento de las células que sobreexpresaron DARS-AS1 y PACT.Estos resultados sugieren que PACT puede contrarrestar el aumento de la proliferación causado por la sobreexpresión de DARS-AS1.
Dado que diferentes regiones de DARS-AS1 tienen diferentes capacidades de unión a PACT, investigamos su influencia relativa en la proliferación celular mediante diferentes sobreexpresiones de fragmentos de DARS-AS1.En comparación con los otros dos fragmentos, DARS-AS1 se sobreexpresó en el extremo 3 '(384–768 nt), la principal región relacionada con PACT en DARS-AS1, que tenía la mayor capacidad para estimular la proliferación celular (Fig. 3j).Estos resultados indican una correlación positiva entre la capacidad de unión y la función biológica de DARS-AS1.
Se ha informado que PACT es una proteína proapoptótica19.Por lo tanto, investigamos el efecto de DARS-AS1 en la apoptosis.Como se esperaba, la eliminación de DARS-AS1 aumentó significativamente la escisión de PARP en las células SW620 y aumentó la proporción de células positivas para anexina V en las líneas celulares SW620, HCT116, HepG2 y MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f-h), lo que indica que el efecto antiapoptótico de DARS-AS1 en las células cancerosas es opuesto a la función inductora de apoptosis de PACT.En conjunto, estos resultados sugieren que el mecanismo de la función oncogénica de DARS-AS1 puede ser a través de la inhibición de la función PACT.
A continuación, exploramos las implicaciones funcionales de la asociación DARS-AS1-PACT.Se ha informado que PACT activa PKR a través de la interacción directa, lo que posteriormente mejora la fosforilación de eIF2α, lo que provoca la eliminación de la traducción y la apoptosis17.Primero, examinamos si DARS-AS1 afecta la localización celular de PACT y PKR.La microscopía de fluorescencia confocal mostró que PACT y PKR estaban altamente colocalizados en células SW620 con un coeficiente de correlación de Pearson promedio de 0,72.Mientras tanto, la sobreexpresión de DARS-AS1 redujo significativamente la colocalización de PACT y PKR (coeficiente de correlación de Pearson medio 0,61) (Figura 4a).Para investigar si DARS-AS1 podría modular la interacción PACT-PKR, realizamos un ensayo de coinmunoprecipitación (co-IP) con anticuerpo anti-PACT en lisados ​​de células SW620.PKR estaba muy enriquecido en anti-PACT en las células de control, mientras que la recuperación de PKR se redujo significativamente en los lisados ​​​​de células que sobreexpresan DARS-AS1 (Fig. 4b).Se usaron PACT y PKR marcados purificados para ensayos de unión a proteínas in vitro.En consecuencia, aquellos que proporcionaron DARS-AS1 pero ningún ARN de control mostraron una interacción PACT-PKR suprimida (Figura 4c).Todos los resultados mostraron que DARS-AS1 interrumpió la comunicación PACT y PKR.
Se observó la colocalización de PACT y PKR en células de control o células que sobreexpresan DARS-AS1 mediante microscopía de fluorescencia confocal.Los núcleos se tiñeron con DAPI.Los resultados estadísticos se obtuvieron a partir de 16 fotografías.b Co-inmunoprecipitación (co-IP) usando anticuerpo anti-PACT en lisados ​​celulares de células SW620 de control o células que sobreexpresan DARS-AS1.c PACT marcado, PKR purificado y transcrito in vitro con DARS-AS1 o ARN simulado se incubaron para el análisis de unión a proteínas in vitro.Se usaron anticuerpos anti-flag para la inmunoprecipitación.d Se realizaron inmunotransferencias con los anticuerpos indicados en células SW620 y HCT116 transfectadas con shRNA de control o DARS-AS1-shRNA seguidas de privación de suero.Los niveles de expresión de DARS-AS1 alteraron la sensibilidad celular a la tapsigargina.Las células SW620 se transfectaron con shRNA de DARS-AS1, plásmido de sobreexpresión de DARS-AS1 o plásmido de control.Las células se trataron con tapsigargina durante 48 horas y se determinó la viabilidad celular usando el reactivo MTS.f Se utilizaron DARS-AS1 transcritos in vitro o ARN ficticio y PACT purificado para el ensayo de activación in vitro y la detección de inmunotransferencia.g Se realizaron inmunotransferencias con estos anticuerpos en células SW620-ctrl (izquierda) o células que sobreexpresan mutantes de PKR (derecha).Luego, estas células se transfectaron con shRNA de control o DARS-AS1-shRNA seguido de inanición de suero.h La citometría de flujo mostró que la inactivación de la PKR mutante compensó la apoptosis inducida por DARS-AS1 en las células SW620.i Se realizaron inmunotransferencias con los anticuerpos indicados en células SW620 (izquierda) o HCT116 (derecha).Las células transfectadas con shRNA de control o shRNA de DARS-AS1 se privan de suero y se complementan con inhibidor de PKR C16 100 nM o DMSO.Barra de escala = 5 µm.Los datos mostrados son la media ± desviación estándar de tres experimentos.* p ≤ 0,05 prueba t de Student de dos colas.
En general, se cree que una vez que PACT interactúa con PKR17, se puede inducir la fosforilación de PKR en Thr451.Nuestros resultados indicaron que el nivel de fosforilación de PKR se elevó significativamente en las células de eliminación de DARS-AS1 después de la inanición de suero (Fig. 4d y Fig. 4a complementaria).En consecuencia, encontramos que la fosforilación de eIF2α, el sustrato principal de PKR, también aumentó significativamente con el shRNA de DARS-AS1 (Fig. 4d y Fig. 4a complementaria).Thapsigargin es un estresante del RE que hace que el RE libere Ca2+.Se ha informado que el tratamiento con tapsigargina induce la expresión y activación de PACT, que además interactúa con PKR y la activa, lo que conduce a la apoptosis al aumentar la fosforilación de eIF2α 18,61.Aquí, usamos thapsigargin como estimulador de la vía PACT/PKR para investigar si DARS-AS1 puede ayudar a las células a superar el estrés al inhibir la vía PACT/PKR.Observamos que el nivel de expresión de DARS-AS1 se correlacionó positivamente con la resistencia celular a la tapsigargina.Las células SW620 que sobreexpresan DARS-AS1 sobrevivieron mejor cuando se trataron con thapsigargin, mientras que las células con caída de DARS-AS1 se volvieron más susceptibles (Fig. 4e).De acuerdo con estos resultados, la sobreexpresión de DARS-AS1 redujo la fosforilación de PKR inducida por thapsigargin (Figura complementaria 4b).En contraste, después del tratamiento con thapsigargin, PKR y eIF2α se fosforilaron en mayor medida en las células de eliminación de DARS-AS1 en comparación con las células de control (Fig. 4b complementaria).Curiosamente, la tapsigargina indujo la expresión de DARS-AS1 de una manera dependiente de la dosis, lo que puede indicar una función antiestrés de DARS-AS1 (Fig. 4c complementaria).Además, realizamos ensayos de activación in vitro para confirmar estas observaciones.Brevemente, la PKR se purificó a partir de lisados ​​celulares usando un anticuerpo anti-PKR, luego se incubó con PACT recombinante y DARS-AS1 transcrito in vitro.Después de la reacción enzimática, se detectó fosfo-PKR usando WB.Nuestros resultados indicaron que la fosforilación de PKR fue inhibida significativamente por DARS-AS1, pero no por el ARN de control (Figura 4f).Estos resultados in vitro e in vivo sugieren que DARS-AS1 inhibe la activación de PKR mediada por PACT.Al mismo tiempo, también observamos una disminución en la recuperación de PACT en presencia de DARS-AS1 (Figura 4f).Este resultado es consistente con los resultados del ensayo de unión a proteínas in vitro (Figura 4c) y nuevamente ilustra la función de bloqueo de DARS-AS1 para la asociación PACT-PKR.
Se requieren Ser246 y Ser287 en el dominio D3 de PACT para la activación de PKR bajo estrés celular.La sustitución de dos residuos de serina por alanina dio PACT mutante (mutD), que activó PKR en ausencia de estrés, y la sustitución de alanina (mutA) invirtió el protocolo.Dado que hemos demostrado la importancia de este dominio en asociación directa con DARS-AS1, generamos estos dos mutantes PACT para probar si estos residuos también podrían estar involucrados en la interacción con DARS-AS1.Curiosamente, ambos mutantes perdieron la capacidad de unirse a DARS-AS1 (Fig. 4d complementaria), lo que sugiere que la estructura completa de la proteína PACT puede ser necesaria para una interacción eficiente con DARS-AS1.
Además, nuestros resultados también sugieren que la inhibición de la proliferación celular inducida por DARS-AS1-shRNA puede restaurarse parcialmente al sobreexpresar un mutante PACT negativo dominante (PACTmutA) o un mutante PKR negativo dominante (PKRmut) (Fig. 4e. e).La sobreexpresión de mutantes de PKR negativos dominantes redujo la fosforilación de PKR inducida por la eliminación de DARS-AS1, así como la fosforilación de eIF2α en células privadas de suero (Fig. 4g).Más importante aún, la proporción de células apoptóticas inducidas por la eliminación de DARS-AS1 también se redujo en las células que sobreexpresan PKRmut (Fig. 4h y Fig. 4g complementaria).La inhibición de la actividad de la quinasa de PKR también afecta la función de DARS-AS1, ya que los resultados mostraron que la caída de DARS-AS1 rara vez desencadenaba la fosforilación de PKR y eIF2α cuando las células se trataban con un inhibidor de C16 específico de PKR (Fig. 4i y Complementario Fig. 4h).).En conjunto, nuestros resultados sugieren que DARS-AS1 promueve la proliferación celular, al menos en parte, al inhibir la activación de PKR mediada por PACT.
Para explorar más a fondo el papel de DARS-AS1 en la tumorigénesis, realizamos experimentos in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto de ratón. Los resultados muestran que la eliminación de DARS-AS1 disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral en ratones (valor de p <0,0001) (Fig. 5a). Los resultados muestran que la eliminación de DARS-AS1 disminuyó drásticamente el crecimiento tumoral en ratones (valor de p <0,0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5). Los resultados muestran que la eliminación de DARS-AS1 reduce drásticamente el crecimiento tumoral en ratones (valor de p <0,0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长 (p 值< 0,0001) (图5a)。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）(图5a)。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение ра <0,0001). Los resultados mostraron que la eliminación de DARS-AS1 redujo significativamente el crecimiento tumoral en ratones (valor de p <0,0001) (Figura 5a).Por lo tanto, en el grupo de desactivación de DARS-AS1, hubo una disminución significativa en el volumen tumoral medio en aproximadamente un 72,9 % y en la masa tumoral media en aproximadamente un 87,8 % (Figura 5b-d).Estos resultados sugieren fuertemente que DARS-AS1 puede promover significativamente el crecimiento tumoral in vivo.
Efectos de la eliminación de anuncios DARS-AS1 en la oncogénesis colorrectal en ratones desnudos.Se muestran las curvas de crecimiento (a), el tamaño del tumor (b), el peso (c) y las imágenes del tumor (d).Las barras de error representan ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, mediante la prueba t de Student de dos colas. n = 10. ****p < 0,0001, mediante la prueba t de Student de dos colas. n = 10. ****p < 0,0001 por двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 prueba t de Student de dos colas.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 por двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 prueba t de Student de dos colas.e Kaplan-Meier analizó la correlación entre los niveles de expresión de DARS-AS1 y la supervivencia global en pacientes con UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM y LGG.Los altos niveles de expresión de DARS-AS1 en los pacientes estaban en el 50 % superior;el bajo nivel de expresión de DARS-AS1 en los pacientes estaba en el 50 % inferior.Los valores de p se determinaron mediante la prueba de rango logarítmico.f Modelo propuesto en el que DARS-AS1 regula la vía PACT-PKR y el crecimiento tumoral.
Para comprender mejor el impacto clínico de DARS-AS1, examinamos la correlación entre su expresión y la supervivencia del paciente.Al analizar el conjunto de datos TCGA, encontramos que una expresión más alta de DARS-AS1 se asoció con melanoma uveal (UVM), cromofobia renal (KICH), carcinoma de células papilares renales (KIRP), mesotelioma (MESO), multiplex.La supervivencia más baja se asoció significativamente con la morfosis del glioblastoma (GBM) y los pacientes con glioma cerebral de bajo grado (LGG) (Figura 5e).Estos resultados sugieren que DARS-AS1 puede desempeñar un papel importante en la progresión clínica del tumor y puede ser un biomarcador predictivo potencial en múltiples tipos de cáncer.
En este estudio, utilizando la detección funcional CRISPRi a gran escala, determinamos que DARS-AS1 lncRNA supera el estrés de las células cancerosas al regular dos respondedores clave al estrés, PACT y PKR.Al interactuar directamente con PACT, DARS-AS1 inhibió la activación de PKR mediada por PACT, evitando así la muerte celular apoptótica y promoviendo la proliferación celular (Fig. 5f).Se ha observado una regulación positiva de DARS-AS1 en múltiples tipos de cáncer, lo que sugiere que su función de promover la supervivencia de las células cancerosas en condiciones estresantes puede ser ampliamente aplicable a múltiples tipos de cáncer.
PACT se ha identificado como una proteína activadora de PKR, y la activación de PKR mediada por PACT desempeña un papel importante en las respuestas al estrés al regular la transcripción, la traducción, la apoptosis y otros procesos celulares importantes62.Durante décadas, se han realizado intentos para comprender la regulación específica del cáncer de la cascada PACT-PKR.Aquí, nuestro estudio reveló un mecanismo diferente de regulación de PACT-PKR en células cancerosas a través de lncRNA DARS-AS1 celular, que se une directamente a PACT, bloquea la interacción PACT-PKR, inhibe la activación de PKR y la fosforilación de eIF2α, lo que inhibe la apoptosis inducida por estrés y estimulando la eventual proliferación del cáncer.células.Este descubrimiento arroja luz sobre posibles objetivos de lncRNA para el pronóstico y la terapia del cáncer.
Nuestros datos mostraron que la caída de DARS-AS1 sensibiliza a las células a la inanición de suero con un aumento significativo en PKR fosforilado y eIF2α.Estos resultados sugieren que DARS-AS1 promueve la supervivencia de las células cancerosas en condiciones adversas al inhibir la actividad de PACT/PKR.Varios otros ARN no codificantes, como ASPACT y nc886, también están involucrados en el eje PACT/PKR al regular a la baja el ARNm de PACT48 o al regular la autofosforilación al unirse a PKR49,50,64.Entre ellos, DARS-AS1 actúa como disruptor de la asociación PACT-PKR.Este estudio enriquece nuestra comprensión de la regulación del eje PACT/PKR y el papel de los lncRNA en las respuestas al estrés.
PACT contiene tres dominios separados.Cada uno de los dos primeros dsRBD es suficiente para lograr una unión de alta afinidad de PACT a PKR, mientras que el tercer dominio (D3) es necesario para la activación de PKR in vitro e in vivo.Nuestro estudio mostró que DARS-AS1 interactúa preferentemente con el dominio D3 (Fig. 3h).Dado el gran tamaño del lncRNA (768 nucleótidos), la unión de DARS-AS1 a D3 puede inhibir físicamente la interacción entre el dominio PACT de dsRBD y PKR, bloqueando así la asociación de PACT y PKR.Las mutaciones puntuales de PACT que reemplazaron Ser246 y Ser287 en D3 con alanina o aspartato interrumpieron su afinidad de unión por DARS-AS1, lo que apunta a la importancia de las propiedades estructurales y eléctricas generales de D3 en su asociación.Se requerirán más detalles de este mecanismo en el futuro, utilizando un análisis bioquímico más preciso y un análisis estructural PACT de alta resolución.
Estudios previos han informado que DARS-AS1 promueve la proliferación celular a través de varios mecanismos51,52,53.En un ejemplo, los investigadores observaron que DARS-AS1 regulaba al alza su gen DARS que codifica la proteína antisentido al dirigirse a miP-194-5p en células de cáncer de riñón.Sin embargo, en el presente estudio, la eliminación de DARS-AS1 tuvo poco efecto en la transcripción de DARS en múltiples tipos de cáncer, incluidos al menos los cánceres colorrectal, de mama y de hígado.Debido a que los lncRNA exhiben patrones de expresión específicos de células y tejidos, es posible que los mecanismos funcionales no se conserven en todos los tipos de cáncer, lo que puede contribuir a esta discrepancia entre nuestras observaciones y evaluaciones previas de diferentes tipos de cáncer.Se necesitan estudios especiales para dilucidar los mecanismos específicos de varios procesos fisiológicos y patológicos.
Un análisis de datos clínicos mostró que la expresión de DARS-AS1 en tumores está inversamente correlacionada con la supervivencia de pacientes con cáncer, lo que subraya la importancia del eje DARS-AS1/PACT/PKR en el pronóstico del cáncer.En conclusión, nuestro estudio muestra que DARS-AS1 es un regulador del eje de señalización PACT/PKR, promueve la proliferación de células cancerosas e inhibe la apoptosis durante la respuesta al estrés, lo que proporciona otra línea de investigación y es de interés para futuras investigaciones sobre posibles tratamientos. .
Las líneas celulares humanas SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 y HEK293T se obtuvieron de la Infraestructura Nacional de Recursos de Línea Celular en China.Todas las células se mantuvieron en medio DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suplementado con FBS al 10 % (Gemini, Brooklyn, NY) y penicilina-estreptomicina al 1 % (Thermo Fisher Scientific) a 37 °C, CO2 al 5 %.incubadora.
Anti-PACTO, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fósforo S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fósforo S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulina, CST (2128);IgG de ratón normal, CST (5415S);IgG de conejo normal, CST (2729S).Los anticuerpos se diluyeron 1:1000 en PBST para transferencia Western y 1:100 para IP.
Los sgRNA se desarrollaron utilizando una herramienta disponible públicamente llamada CRISPR-ERA66.Utilizamos los parámetros de la herramienta predeterminada para el desarrollo de sgRNA y el algoritmo calculó los sitios de unión de sgRNA en la región de 3 kb.centrado en TSS.Los grupos de oligonucleótidos de sgRNA se sintetizaron en CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) y se clonaron en plásmidos de pgRNA humanizados (Addgene #44248).Se cotransfectaron un total de 12 µg de plásmido pgRNA humanizado combinado, 7,2 µg de psPAX2 (Addgene n.° 12260) y 4,8 μg de pMD2.G (Addgene n.° 12259) en 5 x 106 HEK293T en placas de 10 cm utilizando el reactivo de transfección DNAfect. celdas (CWBIO, Beijing, China) siguiendo las instrucciones del fabricante.Los sobrenadantes que contenían virus se recogieron 48 y 72 horas después de la transfección y se filtraron a través de un filtro de 0,45 µm.Para el cribado, se obtuvieron células SW620 que expresan la proteína de fusión dCas9/KRAB mediante transducción de virus.Se infectaron células SW620 modificadas con la biblioteca de virus en cuatro experimentos de infección independientes a una MOI de 0,1-0,3 y se tomaron muestras con 2 μg/ml de puromicina (Sigma, St. Louis, MO) durante 2 días.A partir de entonces, las células se cultivaron durante 18 días in vitro con una cobertura de biblioteca mínima de 500 células/sgRNA para el cribado.
El ADN genómico se extrajo de acuerdo con las instrucciones del QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Alemania; 51183).En total, se usaron 100 μg de ADN genómico por repetición biológica para construir la biblioteca.La región de sgRNA se amplificó mediante dos rondas de PCR y se vinculó a un código de barras.
Los productos de PCR se purificaron con el gel NucleoSpin® y el kit de purificación de PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Alemania; 740609.250) y se cuantificaron con el kit de detección de ADN de doble cadena Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
El ensayo MTS se usó para medir la proliferación celular.Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad inicial de 2000 células/pocillo.El número relativo de células se midió diariamente a la hora indicada durante un total de 4-6 días.Para cada pocillo, se diluyeron 20 μl de reactivo MTS (Promega) con 100 μl de DMEM, se incubaron con células durante 4 ha 37 °C y luego se midió la DO490.
La capacidad de crecimiento no anclado se descubrió analizando la formación de esferas.Brevemente, se cultivaron 2000 células transfectadas con shRNA DARS-AS1 o shRNA de control en microplacas de unión ultrabaja (Corning) con cambio de medio cada 4 días.Los esferoides se contaron después de 14 días.Se usaron 500 células transfectadas con el plásmido de sobreexpresión de DARS-AS1 o un plásmido de control para el ensayo de mejora; por lo demás, el método no se modificó.
El ARN se transcribió usando ARN polimerasa T7 y biotina-16-UTP (Roche 1138908910) de acuerdo con las instrucciones de Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Los cebadores utilizados aquí se enumeran en la Tabla complementaria 4.
Las regiones PACT o PKR que codifican proteínas se clonaron en pET15b (Addgene #73619) y se transformaron en BL21 (DE3).Las bacterias se incubaron durante la noche en LB suministrado con ampicilina y luego se diluyeron 100 veces con LB fresco.Cuando la DO600 del medio alcanzó 0,8, se añadió IPTG 1 mM para inducir la expresión de la proteína.Después de la incubación durante la noche con agitación suave (250 rpm a 20 °C), el sedimento celular se recogió mediante centrifugación (4000 rpm, 10 min, 4 °C).Resuspender el sedimento celular en tampón de lisis (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) e incubar en hielo durante 30 min, luego someter a ultrasonidos (15 min, 5 s encendido/apagado, en hielo) y centrifugar (13 000 rpm)., 30 min, 4°С).A continuación, el sobrenadante se cargó en resina Ni-NTA (QIAGEN) 3 veces a 4 °C, se lavó 4 veces con tampón de lavado (Tris 50 mM, pH 8,0, imidazol 40 mM, NaCl 250 mM) y se eluyó 3 veces, con un total de de 10 ml de tampón eluyente (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 250 mM, imidazol 300 mM).La proteína purificada se determinó mediante WB y la concentración se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Los ensayos RIP se realizaron como se describió anteriormente, con modificaciones.En resumen, tampón RIP 1x (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, NP-40 al 0,5 %, inhibidor de la ribonucleasa de ARNasina (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), DDM 1 mM, proteasa) lisa el cóctel citostático 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) y centrifugar a 13.000 rpm durante 15 min a 4 °C.A continuación, el sobrenadante se incubó con perlas magnéticas de proteína A+G (Millipore) conjugadas con 5 µg de anticuerpo anti-PACT (Abeam) o IgG (CST).Las perlas se lavaron 5 veces con tampón RIP 5x y luego se digirieron con proteinasa K (NEB).El ARN se extrajo con Trizol y se determinó mediante RT-qPCR.Los cebadores se presentan en la Tabla complementaria 5.
El ensayo RIP in vitro se realizó de acuerdo con un protocolo de ensayo RIP estándar modificado.Se diluyó un total de 5 pmol de ARN transcrito in vitro 1x con tampón RIP y se reasoció mediante incubación a 65 °C durante 5 minutos seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente.Se purificaron un total de 5 pmol de proteínas PACT marcadas con bandera intactas o mutadas a partir de E. coli.Incube con ARN renaturalizado durante 2 horas a 4 °C y siga el procedimiento anterior para el análisis RIP para IP anti-flag.
Para el análisis de extensión de ARN, se lisaron 1x107 células con tampón 1xRIP.Después de la centrifugación a 13.000 rpm durante 15 min a 4 °C, el sobrenadante se pretrató con 30 μl de perlas magnéticas de estreptavidina (Beckman) durante 2 ha 4 °C.Luego, el lisado purificado se suministró ARNt de levadura y se incubó con 40 pmol de ARN renaturalizado durante la noche a 4 °C, luego durante otras 2 horas y se agregaron 20 μl de nuevas perlas magnéticas de estreptavidina bloqueadas con BSA.El paso de lavado consistió en 4 veces con tampón RIP 5x y 4 veces con tampón RIP 1x.Las proteínas correspondientes se eluyeron con tampón de elución de biotina (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, D-biotina 12,5 mM, PMSF) y se separaron en NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Después de la tinción con plata (Beyotime Biotechnology), se extirparon ciertas bandas y se analizaron por MS.
Se realizó un análisis de Co-IP para probar la interacción entre PACT y PKR.Brevemente, los lisados ​​sobrenadantes se prepararon incubando 1 x 107 células lisadas en 1 x tampón RIP seguido de centrifugación a 13.000 rpm durante 15 minutos a 4°C.Los lisados ​​se cargaron con perlas magnéticas de proteína A + G, se conjugaron con 5 µg de anticuerpo anti-PACT y se rotaron suavemente durante la noche a 4 °C.Las perlas se lavaron 3 veces con tampón RIP 5x, dos veces con tampón RIP 1x y se eluyeron con tampón SDS 1x.La proteína recuperada se analizó mediante gel SDS-PAGE y se detectó mediante WB.
Dos pmol de PACT marcado y 1 pmol de PKR se purificaron a partir de E. coli.Diluir en tampón RIP 1x e incubar con 10 pmol de ARN renaturalizado durante 2 horas a 4 °C.Después de eso, se incubaron con anticuerpo antimarcado conjugado con perlas magnéticas de proteína A+G durante dos horas más.A continuación, las perlas se lavaron cuatro veces con tampón RIP 1x y se eluyeron con tampón SDS 1x.El PACT y el PKR resultantes fueron detectados por WB.