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Los fotosensibilizadores efectivos son especialmente importantes para el uso clínico generalizado de la fototerapia.Sin embargo, los fotosensibilizadores convencionales generalmente sufren de absorción de longitud de onda corta, fotoestabilidad insuficiente, bajo rendimiento cuántico de especies reactivas de oxígeno (ROS) y extinción de ROS inducida por agregación.Aquí informamos sobre un fotosensibilizador supramolecular (RuDA) de infrarrojo cercano (NIR) mediado por el autoensamblaje de complejos organometálicos de Ru (II) -areno en solución acuosa.RuDA solo puede generar oxígeno singulete (1O2) en el estado agregado, y exhibe un comportamiento de generación de 1O2 inducido por agregación obvio debido a un aumento significativo en el proceso de cruce entre el sistema singlete-triplete.Bajo la acción de la luz láser de 808 nm, RuDA exhibe un rendimiento cuántico de 1O2 del 16,4 % (verde de indocianina aprobado por la FDA: ΦΔ=0,2 %) y una alta eficiencia de conversión fototérmica del 24,2 % (nanovarillas de oro comerciales) con excelente fotoestabilidad.: 21,0 %, nanocápsulas de oro: 13,0 %).Además, las RuDA-NP con buena biocompatibilidad pueden acumularse preferentemente en los sitios del tumor, lo que provoca una regresión significativa del tumor durante la terapia fotodinámica con una reducción del 95,2 % en el volumen del tumor in vivo.Esta terapia fotodinámica potenciadora de la agregación proporciona una estrategia para desarrollar fotosensibilizadores con propiedades fotofísicas y fotoquímicas favorables.
En comparación con la terapia convencional, la terapia fotodinámica (TFD) es un tratamiento atractivo para el cáncer debido a sus importantes ventajas, como el control espaciotemporal preciso, la no invasividad, la resistencia farmacológica insignificante y la minimización de los efectos secundarios 1,2,3.Bajo la irradiación de luz, los fotosensibilizadores utilizados pueden activarse para formar especies de oxígeno altamente reactivas (ROS), lo que provoca apoptosis/necrosis o respuestas inmunitarias4,5. Sin embargo, la mayoría de los fotosensibilizadores convencionales, como las clorinas, las porfirinas y las antraquinonas, tienen una absorción de longitud de onda relativamente corta (frecuencia < 680 nm), lo que resulta en una mala penetración de la luz debido a la intensa absorción de moléculas biológicas (p. ej., hemoglobina y melanina) en la región visible6,7. Sin embargo, la mayoría de los fotosensibilizadores convencionales, como las clorinas, las porfirinas y las antraquinonas, tienen una absorción de longitud de onda relativamente corta (frecuencia < 680 nm), lo que resulta en una mala penetración de la luz debido a la intensa absorción de moléculas biológicas (p. ej., hemoglobina y melanina) en la región visible6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Sin embargo, los fotosensibilizadores más comunes, como las clorinas, las porfirinas y las antraquinonas, tienen una absorción de longitud de onda relativamente corta (< 680 nm), lo que da como resultado una escasa penetración de la luz debido a la intensa absorción de moléculas biológicas (p. ej., hemoglobina y melanina) en la región visible6,7.然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， ， 如 二 氢 卟酚 、 卟啉 和 蒽醌 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 <680 nm） ， 因此 对 对 生物 分子 （如 血红 蛋白 和 黑色素） 的 强烈 吸收 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 eléctrico导致光穿透性差。然而 ， 大多数 大多数 传统 的 光敏剂 ， ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， ， 具有 相对 较 短 短 的 波长 （频率 频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 和） 的 的 ， ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 eléctrico eléctrica吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 Hola Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Sin embargo, la mayoría de los fotosensibilizadores tradicionales, como las clorinas, las porfirinas y las antraquinonas, tienen una absorción de longitud de onda relativamente corta (frecuencia < 680 nm) debido a la fuerte absorción de biomoléculas como la hemoglobina y la melanina, lo que da como resultado una escasa penetración de la luz.Área visible 6.7.Por lo tanto, los fotosensibilizadores que absorben el infrarrojo cercano (NIR) que se activan en la "ventana terapéutica" de 700 a 900 nm son muy adecuados para la fototerapia.Dado que la luz infrarroja cercana es la menos absorbida por los tejidos biológicos, puede conducir a una penetración más profunda y menos fotodaño8,9.
Desafortunadamente, los fotosensibilizadores que absorben NIR existentes generalmente tienen poca fotoestabilidad, baja capacidad de generación de oxígeno singulete (1O2) y extinción de 1O2 inducida por agregación, lo que limita su aplicación clínica10,11.Aunque se han realizado grandes esfuerzos para mejorar las propiedades fotofísicas y fotoquímicas de los fotosensibilizadores convencionales, hasta el momento varios informes han informado que los fotosensibilizadores que absorben NIR pueden resolver todos estos problemas.Además, varios fotosensibilizadores se han mostrado prometedores para la generación eficiente de 1O212,13,14 cuando se irradian con luz por encima de 800 nm, ya que la energía del fotón disminuye rápidamente en la región del IR cercano.Trifenilamina (TFA) como donante de electrones y [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazina (TDP) como grupo aceptor de electrones Tintes de tipo donante-aceptor (DA) una clase de colorantes , que absorben el infrarrojo cercano, que se han estudiado ampliamente para la bioimagen II del infrarrojo cercano y la terapia fototérmica (PTT) debido a su estrecha banda prohibida.Por lo tanto, los tintes de tipo DA se pueden usar para la TFD con excitación en el IR cercano, aunque rara vez se han estudiado como fotosensibilizadores para la TFD.
Es bien sabido que la alta eficiencia de cruce entre sistemas (ISC) de los fotosensibilizadores promueve la formación de 1O2.Una estrategia común para avanzar en el proceso de ISC es mejorar el acoplamiento espín-órbita (SOC) de los fotosensibilizadores mediante la introducción de átomos pesados ​​o restos orgánicos especiales.Sin embargo, este enfoque todavía tiene algunas desventajas y limitaciones19,20.Recientemente, el autoensamblaje supramolecular ha proporcionado un enfoque inteligente de abajo hacia arriba para la fabricación de materiales funcionales a nivel molecular,21,22 con numerosas ventajas en fototerapia: (1) los fotosensibilizadores autoensamblados pueden tener el potencial de formar estructuras de cinta.Similar a las estructuras electrónicas con una distribución más densa de los niveles de energía debido a la superposición de órbitas entre los bloques de construcción.Por lo tanto, se mejorará la coincidencia de energía entre el estado excitado del singlete inferior (S1) y el estado excitado del triplete vecino (Tn), lo que es beneficioso para el proceso ISC 23, 24.(2) El ensamblaje supramolecular reducirá la relajación no radiativa basada en el mecanismo de limitación del movimiento intramolecular (RIM), que también promueve el proceso ISC 25, 26.(3) El ensamblaje supramolecular puede proteger las moléculas internas del monómero de la oxidación y la degradación, lo que mejora en gran medida la fotoestabilidad del fotosensibilizador.Dadas las ventajas anteriores, creemos que los sistemas fotosensibilizadores supramoleculares pueden ser una alternativa prometedora para superar las deficiencias de la TFD.
Los complejos basados ​​en Ru(II) son una plataforma médica prometedora para aplicaciones potenciales en el diagnóstico y la terapia de enfermedades debido a sus propiedades biológicas únicas y atractivas28,29,30,31,32,33,34.Además, la abundancia de estados excitados y las propiedades fotofisicoquímicas ajustables de los complejos basados ​​en Ru(II) brindan grandes ventajas para el desarrollo de fotosensibilizadores basados ​​en Ru(II)35,36,37,38,39,40.Un ejemplo notable es el complejo de polipiridilo de rutenio (II) TLD-1433, que actualmente se encuentra en ensayos clínicos de fase II como fotosensibilizador para el tratamiento del cáncer de vejiga no músculo invasivo (NMIBC)41.Además, los complejos organometálicos de rutenio(II)areno son ampliamente utilizados como agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer debido a su baja toxicidad y facilidad de modificación42,43,44,45.Las propiedades iónicas de los complejos organometálicos de Ru(II)-areno no solo pueden mejorar la escasa solubilidad de los cromóforos DA en disolventes comunes, sino también mejorar el ensamblaje de los cromóforos DA.Además, la estructura semisandwich pseudooctaédrica de los complejos organometálicos de Ru(II)-arenos puede prevenir estéricamente la agregación H de los cromóforos de tipo DA, lo que facilita la formación de agregación J con bandas de absorción desplazadas hacia el rojo.Sin embargo, las desventajas inherentes de los complejos de Ru(II)-areno, como la baja estabilidad y/o la escasa biodisponibilidad, pueden afectar la eficacia terapéutica y la actividad in vivo de los complejos de areno-Ru(II).Sin embargo, los estudios han demostrado que estas desventajas pueden superarse encapsulando complejos de rutenio con polímeros biocompatibles mediante encapsulación física o conjugación covalente.
En este trabajo, informamos complejos conjugados con DA de Ru(II)-areno (RuDA) con un activador NIR a través de un enlace de coordinación entre el cromóforo DAD y el resto Ru(II)-areno.Los complejos resultantes pueden autoensamblarse en vesículas metalosupramoleculares en agua debido a interacciones no covalentes.En particular, el ensamblaje supramolecular dotó a RuDA de propiedades de cruce entre sistemas inducidas por polimerización, lo que aumentó significativamente la eficiencia de ISC, lo que fue muy favorable para PDT (Fig. 1A).Para aumentar la acumulación de tumores y la biocompatibilidad in vivo, se utilizó Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) aprobado por la FDA para encapsular RuDA47,48,49 para crear nanopartículas de RuDA-NP (Figura 1B) que actuaron como un PDT/ Dual- modo proxy PTT.En la fototerapia del cáncer (Figura 1C), se usó RuDA-NP para tratar ratones desnudos con tumores MDA-MB-231 para estudiar la eficacia de PDT y PTT in vivo.
Ilustración esquemática del mecanismo fotofísico de RuDA en formas monoméricas y agregadas para fototerapia del cáncer, síntesis de B RuDA-NP y C RuDA-NP para PDT y PTT activados por NIR.
RuDA, que consta de la funcionalidad TPA y TDP, se preparó de acuerdo con el procedimiento que se muestra en la Figura complementaria 1 (Figura 2A), y RuDA se caracterizó mediante espectros de RMN de 1H y 13C, espectrometría de masas de ionización por electropulverización y análisis elemental (Figuras complementarias 2-4 ).El mapa de diferencia de densidad de electrones RuDA de la transición de singlete más baja se calculó mediante la teoría funcional de densidad dependiente del tiempo (TD-DFT) para estudiar el proceso de transferencia de carga.Como se muestra en la Figura 5 complementaria, la densidad de electrones se desplaza principalmente de la trifenilamina a la unidad aceptora de TDP después de la fotoexcitación, lo que se puede atribuir a una transición típica de transferencia de carga intramolecular (CT).
Estructura química del mineral. B Espectros de absorción del mineral en mezclas de varias proporciones de DMF y agua.C Valores de absorción normalizados de RuDA (800 nm) e ICG (779 nm) frente al tiempo a 0,5 W cm-2 de luz láser de 808 nm.D La fotodegradación de ABDA está indicada por la formación de 1O2 inducida por RuDA en mezclas de DMF/H2O con diferentes contenidos de agua bajo la acción de radiación láser con una longitud de onda de 808 nm y una potencia de 0,5 W/cm2.
Resumen: se utilizó la espectroscopia de absorción UV-visible para estudiar las propiedades de autoensamblaje del mineral en mezclas de DMF y agua en diversas proporciones.Como se muestra en la fig.2B, RuDA exhibe bandas de absorción de 600 a 900 nm en DMF con una banda de absorción máxima a 729 nm.El aumento de la cantidad de agua condujo a un cambio gradual hacia el rojo del máximo de absorción de mineral a 800 nm, lo que indica una agregación J de mineral en el sistema ensamblado.Los espectros de fotoluminiscencia de RuDA en diferentes solventes se muestran en la Figura complementaria 6. RuDA parece exhibir una luminiscencia NIR-II típica con una longitud de onda de emisión máxima de ca.1050 nm en CH2Cl2 y CH3OH, respectivamente.El gran cambio de Stokes (alrededor de 300 nm) de RuDA indica un cambio significativo en la geometría del estado excitado y la formación de estados excitados de baja energía.Se determinó que los rendimientos cuánticos de luminiscencia del mineral en CH2Cl2 y CH3OH eran 3,3 y 0,6 %, respectivamente.Sin embargo, en una mezcla de metanol y agua (5/95, v/v), se observó un ligero desplazamiento hacia el rojo de la emisión y una disminución del rendimiento cuántico (0,22 %), lo que puede deberse al autoensamblaje del mineral. .
Para visualizar el autoensamblaje de ORE, utilizamos microscopía de fuerza atómica líquida (AFM) para visualizar los cambios morfológicos en ORE en solución de metanol después de agregar agua.Cuando el contenido de agua estaba por debajo del 80%, no se observó una agregación clara (Fig. 7 complementaria).Sin embargo, con un mayor aumento en el contenido de agua al 90–95 %, aparecieron pequeñas nanopartículas, lo que indicaba el autoensamblaje de Ore. Además, la irradiación láser con una longitud de onda de 808 nm no afectó la intensidad de absorción de RuDA en agua. solución (Fig. 2C y Fig. 8 complementaria).Por el contrario, la absorbancia del verde de indocianina (ICG como control) cayó rápidamente a 779 nm, lo que indica una excelente fotoestabilidad de RuDA.Además, la estabilidad de las RuDA-NP en PBS (pH = 5,4, 7,4 y 9,0), FBS al 10 % y DMEM (glucosa alta) se examinó mediante espectroscopia de absorción UV-visible en varios momentos.Como se muestra en la Figura complementaria 9, se observaron ligeros cambios en las bandas de absorción de RuDA-NP en PBS a pH 7,4/9,0, FBS y DMEM, lo que indica una excelente estabilidad de RuDA-NP.Sin embargo, en un medio ácido (rН = 5,4) se encontró hidrólisis de mineral.También evaluamos más a fondo la estabilidad de RuDA y RuDA-NP utilizando métodos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).Como se muestra en la Figura complementaria 10, RuDA fue estable en una mezcla de metanol y agua (50/50, v/v) durante la primera hora y se observó hidrólisis después de 4 horas.Sin embargo, solo se observó un pico ancho cóncavo-convexo para RuDA NP.Por lo tanto, se utilizó cromatografía de permeación en gel (GPC) para evaluar la estabilidad de RuDA NP en PBS (pH = 7,4).Como se muestra en la Figura complementaria 11, después de 8 horas de incubación en las condiciones probadas, la altura del pico, el ancho del pico y el área del pico de NP RuDA no cambiaron significativamente, lo que indica una excelente estabilidad de NP RuDA.Además, las imágenes TEM mostraron que la morfología de las nanopartículas RuDA-NP se mantuvo prácticamente sin cambios después de 24 horas en tampón PBS diluido (pH = 7,4, figura complementaria 12).
Debido a que el autoensamblaje puede conferir diferentes características funcionales y químicas al mineral, observamos la liberación de ácido 9,10-antracenodiilbis(metileno)dimalónico (ABDA, indicador 1O2) en mezclas de metanol y agua.Mineral con diferente contenido de agua50.Como se muestra en la Figura 2D y la Figura complementaria 13, no se observó degradación de ABDA cuando el contenido de agua estaba por debajo del 20 %.Con un aumento de la humedad al 40 %, se produjo la degradación de ABDA, como se evidencia por una disminución en la intensidad de la fluorescencia de ABDA.También se ha observado que un mayor contenido de agua da como resultado una degradación más rápida, lo que sugiere que el autoensamblaje de RuDA es necesario y beneficioso para la degradación de ABDA.Este fenómeno es muy diferente de los cromóforos ACQ (agregación inducida por extinción) modernos.Cuando se irradia con un láser con una longitud de onda de 808 nm, el rendimiento cuántico de 1O2 RuDA en una mezcla de 98 % H2O/2 % DMF es de 16,4 %, que es 82 veces mayor que el de ICG (ΦΔ = 0,2 %)51, demostrando una notable eficiencia de generación de 1O2 RuDA en estado de agregación.
Espines de electrones utilizando 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinona (TEMP) y N-óxido de 5,5-dimetil-1-pirrolina (DMPO) como trampas de espín Se utilizó espectroscopia de resonancia (ESR) para identificar las especies resultantes AFK.por RuDA.Como se muestra en la Figura complementaria 14, se ha confirmado que se genera 1O2 en tiempos de irradiación entre 0 y 4 minutos.Además, cuando se incubó RuDA con DMPO bajo irradiación, se detectó una señal EPR típica de cuatro líneas de aducto DMPO-OH· 1:2:2:1, lo que indica la formación de radicales hidroxilo (OH·).En general, los resultados anteriores demuestran la capacidad de RuDA para estimular la producción de ROS a través de un proceso de fotosensibilización dual tipo I/II.
Para comprender mejor las propiedades electrónicas de RuDA en formas monoméricas y agregadas, se calcularon los orbitales moleculares fronterizos de RuDA en formas monoméricas y diméricas mediante el método DFT.Como se muestra en la fig.3A, el orbital molecular ocupado más alto (HOMO) de RuDA monomérico se deslocaliza a lo largo de la columna vertebral del ligando y el orbital molecular desocupado más bajo (LUMO) se centra en la unidad aceptora de TDP.Por el contrario, la densidad de electrones en el HOMO dimérico se concentra en el ligando de una molécula de RuDA, mientras que la densidad de electrones en el LUMO se concentra principalmente en la unidad aceptora de otra molécula de RuDA, lo que indica que RuDA está en el dímero.Características de la TC.
A El HOMO y LUMO de Ore se calculan en formas monoméricas y diméricas.B Niveles de energía singlete y triplete del mineral en monómeros y dímeros.C Niveles estimados de RuDA y posibles canales ISC como monomérico C y dimérico D. Las flechas indican posibles canales ISC.
La distribución de electrones y huecos en los estados excitados singlete de baja energía de RuDA en las formas monomérica y dimérica se analizó utilizando el software Multiwfn 3.852.53, que se calcularon utilizando el método TD-DFT.Como se indica en la etiqueta adicional.Como se muestra en las Figuras 1-2, los huecos RDA monoméricos se deslocalizan principalmente a lo largo del esqueleto del ligando en estos estados excitados singulete, mientras que los electrones se ubican principalmente en el grupo TDP, lo que demuestra las características intramoleculares de CT.Además, para estos estados excitados de singlete, hay más o menos superposición entre los huecos y los electrones, lo que sugiere que estos estados excitados de singlete contribuyen en parte a la excitación local (LE).Para los dímeros, además de las características intramoleculares de CT y LE, se observó una cierta proporción de características intermoleculares de CT en los estados respectivos, especialmente S3, S4, S7 y S8, según el análisis de CT intermolecular, con transiciones intermoleculares de CT como las principales. (Cuadro Suplementario).3).
Para comprender mejor los resultados experimentales, exploramos más a fondo las propiedades de los estados excitados de RuDA para explorar las diferencias entre monómeros y dímeros (Tablas complementarias 4–5).Como se muestra en la Figura 3B, los niveles de energía de los estados excitados singlete y triplete del dímero son mucho más densos que los del monómero, lo que ayuda a reducir la brecha de energía entre S1 y Tn. Se ha informado que las transiciones ISC podrían realizarse dentro de una pequeña brecha de energía (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 y Tn54. Se ha informado que las transiciones ISC podrían realizarse dentro de una pequeña brecha de energía (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 y Tn54. Сообщалось, что переходы isc могт ы regalo Se ha informado que las transiciones ISC se pueden realizar dentro de una pequeña brecha de energía (ΔES1-Tn <0.3 eV) entre S1 y Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход Isc мет ы regalo Se ha informado que la transición ISC se puede realizar dentro de una pequeña brecha de energía (ΔES1-Tn < 0,3 eV) entre S1 y Tn54.Además, solo un orbital, ocupado o desocupado, debe diferir en los estados ligados de singlete y triplete para proporcionar una integral de SOC distinta de cero.Por lo tanto, con base en el análisis de la energía de excitación y la transición orbital, todos los canales posibles de la transición ISC se muestran en las Figs.3C, D.En particular, solo un canal ISC está disponible en el monómero, mientras que la forma dimérica tiene cuatro canales ISC que pueden mejorar la transición ISC.Por lo tanto, es razonable suponer que cuantas más moléculas de RuDA se agreguen, más accesibles serán los canales ISC.Por lo tanto, los agregados de RuDA pueden formar estructuras electrónicas de dos bandas en los estados de singlete y triplete, reduciendo la brecha de energía entre S1 y Tn disponible, aumentando así la eficiencia de ISC para facilitar la generación de 1O2.
Para dilucidar aún más el mecanismo subyacente, sintetizamos un compuesto de referencia del complejo areno-Ru (II) (RuET) reemplazando dos grupos etilo con dos grupos trifenilamina fenilo en RuDA (Fig. 4A, para una caracterización completa, consulte ESI, Complementario 15 -21 ) De donante (dietilamina) a aceptor (TDF), RuET tiene las mismas características intramoleculares de CT que RuDA.Como se esperaba, el espectro de absorción de RuET en DMF mostró una banda de transferencia de carga de baja energía con una fuerte absorción en la región del infrarrojo cercano en la región de 600–1100 nm (Fig. 4B).Además, también se observó la agregación de RuET con el aumento del contenido de agua, lo que se reflejó en el desplazamiento hacia el rojo del máximo de absorción, que se confirmó aún más mediante imágenes de AFM líquido (Fig. 22 complementaria).Los resultados muestran que RuET, como RuDA, puede formar estados intramoleculares y autoensamblarse en estructuras agregadas.
Estructura química de RuET.B Espectros de absorción de RuET en mezclas de varias proporciones de DMF y agua.Parcelas C EIS Nyquist para RuDA y RuET.Respuestas de fotocorriente D de RuDA y RuET bajo la acción de radiación láser con una longitud de onda de 808 nm.
La fotodegradación de ABDA en presencia de RuET se evaluó mediante irradiación con un láser con una longitud de onda de 808 nm.Sorprendentemente, no se observó degradación de ABDA en varias fracciones de agua (Fig. 23 complementaria).Una posible razón es que RuET no puede formar eficientemente una estructura electrónica en bandas porque la cadena de etilo no promueve una transferencia de carga intermolecular eficiente.Por lo tanto, se realizaron medidas de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) y fotocorriente transitoria para comparar las propiedades fotoelectroquímicas de RuDA y RuET.Según el diagrama de Nyquist (Figura 4C), RuDA muestra un radio mucho más pequeño que RuET, lo que significa que RuDA56 tiene un transporte de electrones intermolecular más rápido y una mejor conductividad.Además, la densidad de fotocorriente de RuDA es mucho mayor que la de RuET (Fig. 4D), lo que confirma la mejor eficiencia de transferencia de carga de RuDA57.Por lo tanto, el grupo fenilo de la trifenilamina en Ore juega un papel importante en la transferencia de carga intermolecular y la formación de una estructura electrónica en bandas.
Para aumentar la acumulación de tumores y la biocompatibilidad in vivo, encapsulamos aún más RuDA con F127.Se determinó que el diámetro hidrodinámico promedio de RuDA-NP era de 123,1 nm con una distribución estrecha (PDI = 0,089) utilizando el método de dispersión de luz dinámica (DLS) (Figura 5A), que promovió la acumulación de tumores al aumentar la permeabilidad y la retención.EPR) efecto.Las imágenes de TEM mostraron que las NP de mineral tienen una forma esférica uniforme con un diámetro promedio de 86 nm.En particular, el máximo de absorción de los RuDA-NP apareció a 800 nm (Fig. 24 complementaria), lo que indica que los RuDA-NP pueden conservar las funciones y propiedades de los RuDA autoensamblados.El rendimiento cuántico de ROS calculado para NP Ore es del 15,9%, que es comparable al de Ore. Las propiedades fototérmicas de RuDA NP se estudiaron bajo la acción de radiación láser con una longitud de onda de 808 nm utilizando una cámara infrarroja.Como se muestra en la fig.5B,C, el grupo de control (solo PBS) experimentó un ligero aumento en la temperatura, mientras que la temperatura de la solución de RuDA-NP aumentó rápidamente al aumentar la temperatura (ΔT) a 15,5, 26,1 y 43,0 °C.Las altas concentraciones fueron de 25, 50 y 100 µM, respectivamente, lo que indica un fuerte efecto fototérmico de RuDA NP.Además, se tomaron medidas del ciclo de calentamiento/enfriamiento para evaluar la estabilidad fototérmica de RuDA-NP y compararla con ICG.La temperatura de las NP de Ore no disminuyó después de cinco ciclos de calentamiento/enfriamiento (Fig. 5D), lo que indica la excelente estabilidad fototérmica de las NP de Ore.Por el contrario, ICG exhibe una menor estabilidad fototérmica como se ve por la aparente desaparición de la meseta de temperatura fototérmica en las mismas condiciones.De acuerdo con el método anterior58, la eficiencia de conversión fototérmica (PCE) de RuDA-NP se calculó en 24,2 %, que es más alta que la de los materiales fototérmicos existentes, como las nanovarillas de oro (21,0 %) y las nanocápsulas de oro (13,0 %)59.Por lo tanto, NP Ore exhibe excelentes propiedades fototérmicas, lo que los convierte en agentes PTT prometedores.
Análisis de imágenes DLS y TEM de RuDA NP (recuadro).B Imágenes térmicas de varias concentraciones de RuDA NP expuestas a radiación láser a una longitud de onda de 808 nm (0,5 W cm-2).C Curvas de conversión fototérmica de varias concentraciones de NP de mineral, que son datos cuantitativos.B. D Aumento de temperatura de ORE NP e ICG durante 5 ciclos de calefacción y refrigeración.
La fotocitotoxicidad de RuDA NP contra células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se evaluó in vitro.Como se muestra en la fig.6A, B, RuDA-NP y RuDA exhibieron una citotoxicidad insignificante en ausencia de irradiación, lo que implica una menor toxicidad en la oscuridad de RuDA-NP y RuDA.Sin embargo, después de la exposición a la radiación láser a una longitud de onda de 808 nm, RuDA y RuDA NP mostraron una fuerte fotocitotoxicidad contra las células cancerosas MDA-MB-231 con valores IC50 (concentración inhibitoria media máxima) de 5.4 y 9.4 μM, respectivamente, demostrando que RuDA-NP y RuDA tienen potencial para la fototerapia del cáncer.Además, se investigó más a fondo la fotocitotoxicidad de RuDA-NP y RuDA en presencia de vitamina C (Vc), un eliminador de ROS, para dilucidar el papel de las ROS en la citotoxicidad inducida por la luz.Obviamente, la viabilidad celular aumentó después de la adición de Vc, y los valores de IC50 de RuDA y RuDA NP fueron de 25,7 y 40,0 μM, respectivamente, lo que demuestra el importante papel de ROS en la fotocitotoxicidad de RuDA y RuDA NP.Citotoxicidad inducida por la luz de RuDA-NP y RuDA en células cancerosas MDA-MB-231 mediante tinción de células vivas/muertas usando calceína AM (fluorescencia verde para células vivas) y yoduro de propidio (PI, fluorescencia roja para células muertas).confirmado por las células) como sondas fluorescentes.Como se muestra en la Figura 6C, las células tratadas con RuDA-NP o RuDA permanecieron viables sin irradiación, como lo demuestra la intensa fluorescencia verde.Por el contrario, bajo irradiación láser, solo se observó fluorescencia roja, lo que confirma la fotocitotoxicidad efectiva de RuDA o RuDA NP.Es de destacar que apareció fluorescencia verde tras la adición de Vc, lo que indica una violación de la fotocitotoxicidad de RuDA y RuDA NP.Estos resultados son consistentes con los ensayos de fotocitotoxicidad in vitro.
Viabilidad dependiente de la dosis de células A RuDA- y B RuDA-NP en células MDA-MB-231 en presencia o ausencia de Vc (0,5 mM), respectivamente.Barras de error, media ± desviación estándar (n = 3). Pruebas t no pareadas de dos colas *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Pruebas t no pareadas de dos colas *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 y ***p <0,001. Pruebas t de dos colas no pareadas *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 y ***p <0,001. Pruebas t de dos colas no pareadas *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.C Análisis de tinción de células vivas/muertas utilizando calceína AM y yoduro de propidio como sondas fluorescentes.Barra de escala: 30 µm.Se muestran imágenes representativas de tres repeticiones biológicas de cada grupo.D Imágenes de fluorescencia confocal de la producción de ROS en células MDA-MB-231 bajo diferentes condiciones de tratamiento.La fluorescencia verde DCF indica la presencia de ROS.Irradiar con un láser de 808 nm de longitud de onda con una potencia de 0,5 W/cm2 durante 10 minutos (300 J/cm2).Barra de escala: 30 µm.Se muestran imágenes representativas de tres repeticiones biológicas de cada grupo.E Análisis del tratamiento con RuDA-NP (50 µM) o RuDA (50 µM) por citometría de flujo con o sin láser de 808 nm (0,5 W cm-2) en presencia y ausencia de Vc (0,5 mM) durante 10 min.Se muestran imágenes representativas de tres repeticiones biológicas de cada grupo.F Nrf-2, HSP70 y HO-1 de células MDA-MB-231 tratadas con RuDA-NP (50 µM) con o sin irradiación láser de 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), las células expresan 2).Se muestran imágenes representativas de dos repeticiones biológicas de cada grupo.
La producción intracelular de ROS en células MDA-MB-231 se examinó mediante el método de tinción con diacetato de 2,7-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA).Como se muestra en la fig.6D, las células tratadas con RuDA-NP o RuDA exhibieron una fluorescencia verde distinta cuando se irradiaron con el láser de 808 nm, lo que indica que RuDA-NP y RuDA tienen una capacidad eficiente para generar ROS.Por el contrario, en ausencia de luz o en presencia de Vc, solo se observó una débil señal fluorescente de las células, lo que indicaba una ligera formación de ROS.Los niveles intracelulares de ROS en células RuDA-NP y células MDA-MB-231 tratadas con RuDA se determinaron adicionalmente mediante citometría de flujo.Como se muestra en la Figura complementaria 25, la intensidad de fluorescencia media (MFI) generada por RuDA-NP y RuDA bajo irradiación láser de 808 nm aumentó significativamente en aproximadamente 5,1 y 4,8 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de control, lo que confirma su excelente formación AFK.capacidad.Sin embargo, los niveles intracelulares de ROS en células RuDA-NP o MDA-MB-231 tratadas con RuDA solo fueron comparables a los controles sin irradiación láser o en presencia de Vc, similar a los resultados del análisis de fluorescencia confocal.
Se ha demostrado que las mitocondrias son el principal objetivo de los complejos Ru(II)-areno60.Por lo tanto, se investigó la localización subcelular de RuDA y RuDA-NP.Como se muestra en la Figura complementaria 26, RuDA y RuDA-NP muestran perfiles de distribución celular similares con la mayor acumulación en las mitocondrias (62,5 ± 4,3 y 60,4 ± 3,6 ng/mg de proteína, respectivamente).Sin embargo, solo se encontró una pequeña cantidad de Ru en las fracciones nucleares de Ore y NP Ore (3.5 y 2.1%, respectivamente).La fracción celular restante contenía rutenio residual: 31,7 % (30,6 ± 3,4 ng/mg de proteína) para RuDA y 42,9 % (47,2 ± 4,5 ng/mg de proteína) para RuDA-NP.En general, el mineral y el mineral NP se acumulan principalmente en las mitocondrias.Para evaluar la disfunción mitocondrial, utilizamos la tinción con JC-1 y MitoSOX Red para evaluar el potencial de la membrana mitocondrial y la capacidad de producción de superóxido, respectivamente.Como se muestra en la Fig. 27 complementaria, se observó fluorescencia verde intensa (JC-1) y roja (MitoSOX Red) en células tratadas con RuDA y RuDA-NP bajo irradiación láser de 808 nm, lo que indica que tanto RuDA como RuDA-NP son altamente fluorescentes. Puede inducir efectivamente la despolarización de la membrana mitocondrial y la producción de superóxido.Además, el mecanismo de muerte celular se determinó usando análisis basado en citometría de flujo de anexina V-FITC/yoduro de propidio (PI).Como se muestra en la Figura 6E, cuando se irradiaron con láser de 808 nm, RuDA y RuDA-NP indujeron una tasa de apoptosis temprana significativamente mayor (cuadrante inferior derecho) en células MDA-MB-231 en comparación con PBS o PBS más láser.células procesadas.Sin embargo, cuando se agregó Vc, la tasa de apoptosis de RuDA y RuDA-NP disminuyó significativamente de 50,9 % y 52,0 % a 15,8 % y 17,8 %, respectivamente, lo que confirma el importante papel de las ROS en la fotocitotoxicidad de RuDA y RuDA-NP..Además, se observaron ligeras células necróticas en todos los grupos analizados (cuadrante superior izquierdo), lo que sugiere que la apoptosis puede ser la forma predominante de muerte celular inducida por RuDA y RuDA-NP.
Dado que el daño por estrés oxidativo es un determinante importante de la apoptosis, se investigó el factor nuclear asociado con el factor 2 eritroide 2 (Nrf2) 62, un regulador clave del sistema antioxidante, en MDA-MB-231 tratado con RuDA-NP.Mecanismo de acción de las RuDA NP inducidas por irradiación.Al mismo tiempo, también se detectó la expresión de la proteína hemo oxigenasa 1 aguas abajo (HO-1).Como se muestra en la Figura 6F y la Figura complementaria 29, la fototerapia mediada por RuDA-NP aumentó los niveles de expresión de Nrf2 y HO-1 en comparación con el grupo PBS, lo que indica que los RuDA-NP pueden estimular las vías de señalización del estrés oxidativo.Además, para estudiar el efecto fototérmico de RuDA-NPs63, también se evaluó la expresión de la proteína de choque térmico Hsp70.Está claro que las células tratadas con RuDA-NPs + irradiación con láser de 808 nm mostraron una mayor expresión de Hsp70 en comparación con los otros dos grupos, lo que refleja una respuesta celular a la hipertermia.
Los notables resultados in vitro nos impulsaron a investigar el rendimiento in vivo de RuDA-NP en ratones desnudos con tumores MDA-MB-231.La distribución tisular de RuDA NP se estudió determinando el contenido de rutenio en el hígado, corazón, bazo, riñones, pulmones y tumores.Como se muestra en la fig.7A, el contenido máximo de Ore NP en órganos normales apareció en el primer tiempo de observación (4 h), mientras que el contenido máximo se determinó en tejidos tumorales 8 horas después de la inyección, posiblemente debido a Ore NP.Efecto EPR de LF.De acuerdo con los resultados de la distribución, la duración óptima del tratamiento con mineral NP se tomó 8 horas después de la administración.Para ilustrar el proceso de acumulación de RuDA-NP en sitios tumorales, las propiedades fotoacústicas (PA) de RuDA-NP se controlaron registrando las señales PA de RuDA-NP en diferentes momentos después de la inyección.Primero, la señal de PA de RuDA-NP in vivo se evaluó mediante el registro de imágenes de PA de un sitio tumoral después de la inyección intratumoral de RuDA-NP.Como se muestra en la Figura 30 complementaria, los RuDA-NP mostraron una fuerte señal de PA y hubo una correlación positiva entre la concentración de RuDA-NP y la intensidad de la señal de PA (Figura 30A complementaria).Luego, se registraron imágenes PA in vivo de sitios tumorales después de la inyección intravenosa de RuDA y RuDA-NP en diferentes puntos de tiempo después de la inyección.Como se muestra en la Figura 7B, la señal PA de RuDA-NP del sitio del tumor aumentó gradualmente con el tiempo y alcanzó una meseta a las 8 horas después de la inyección, de acuerdo con los resultados de distribución tisular determinados por el análisis ICP-MS.Con respecto a RuDA (Fig. 30B complementaria), la intensidad máxima de la señal de PA apareció 4 horas después de la inyección, lo que indica una tasa rápida de entrada de RuDA en el tumor.Además, se investigó el comportamiento excretor de RuDA y RuDA-NPs determinando la cantidad de rutenio en orina y heces usando ICP-MS.La ruta principal de eliminación de RuDA (Fig. 31 complementaria) y RuDA-NP (Fig. 7C) es a través de las heces, y se observó una eliminación efectiva de RuDA y RuDA-NP durante el período de estudio de 8 días, lo que significa que RuDA y RuDA-NPs pueden eliminarse eficientemente del cuerpo sin toxicidad a largo plazo.
A. La distribución ex vivo de RuDA-NP en tejidos de ratón se determinó mediante el contenido de Ru (porcentaje de dosis administrada de Ru (ID) por gramo de tejido) en diferentes momentos después de la inyección.Los datos son media ± desviación estándar (n = 3). Pruebas t no pareadas de dos colas *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Pruebas t no pareadas de dos colas *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 y ***p <0,001. Pruebas t de dos colas no pareadas *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 y ***p <0,001. Pruebas t de dos colas no pareadas *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.Imágenes B PA de sitios tumorales in vivo a 808 nm de excitación después de la administración intravenosa de RuDA-NP (10 µmol kg-1) en diferentes momentos.Después de la administración intravenosa de RuDA NP (10 µmol kg-1), los ratones excretaron C Ru con orina y heces en diferentes intervalos de tiempo.Los datos son media ± desviación estándar (n = 3).
La capacidad de calentamiento de RuDA-NP in vivo se estudió en ratones desnudos con tumores MDA-MB-231 y RuDA para comparar.Como se muestra en la fig.8A y la Fig. 32 complementaria, el grupo de control (solución salina) mostró un cambio de temperatura menor (ΔT ≈ 3 °C) después de 10 minutos de exposición continua.Sin embargo, la temperatura de RuDA-NP y RuDA aumentó rápidamente con temperaturas máximas de 55,2 y 49,9 °C, respectivamente, lo que proporcionó hipertermia suficiente para la terapia contra el cáncer in vivo.El aumento observado en la temperatura alta para RuDA NP (ΔT ≈ 24 °C) en comparación con RuDA (ΔT ≈ 19 °C) puede deberse a su mejor permeabilidad y acumulación en los tejidos tumorales debido al efecto EPR.
Imágenes térmicas infrarrojas de ratones con tumores MDA-MB-231 irradiados con láser de 808 nm a diferentes tiempos 8 horas después de la inyección.Se muestran imágenes representativas de cuatro repeticiones biológicas de cada grupo.B Volumen tumoral relativo y C Masa tumoral media de diferentes grupos de ratones durante el tratamiento.D Curvas de pesos corporales de diferentes grupos de ratones.Irradiar con un láser de 808 nm de longitud de onda con una potencia de 0,5 W/cm2 durante 10 minutos (300 J/cm2).Barras de error, media ± desviación estándar (n = 3). Pruebas t no pareadas de dos colas *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Pruebas t no pareadas de dos colas *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 y ***p <0,001. Pruebas t de dos colas no pareadas *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 y ***p <0,001. Pruebas t de dos colas no pareadas *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001. Imágenes de tinción E H&E de los principales órganos y tumores de diferentes grupos de tratamiento, incluidos los grupos de solución salina, solución salina + láser, RuDA, RuDA + láser, RuDA-NP y RuDA-NP + láser. Imágenes de tinción E H&E de los principales órganos y tumores de diferentes grupos de tratamiento, incluidos los grupos de solución salina, solución salina + láser, RuDA, RuDA + láser, RuDA-NP y RuDA-NP + láser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Imágenes de tinción E H&E de los principales órganos y tumores de diferentes grupos de tratamiento, incluidos los grupos de solución salina, solución salina + láser, RuDA, RuDA + láser, RuDA-NP y RuDA-NP + láser.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 激光、RuDA、RuDA + 激光、RuDA-NP-sH&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Tinción E H&E de los principales órganos y tumores de varios grupos de tratamiento, incluidos solución salina, solución salina + láser, RuDA, RuDA + láser, RuDA-NP y RuDA-NP + láser.Barra de escala: 60 µm.
Se evaluó el efecto de la fototerapia in vivo con RuDA y RuDA NPs en los que ratones desnudos con tumores MDA-MB-231 fueron inyectados por vía intravenosa con RuDA o RuDA NPs en una dosis única de 10,0 µmol kg-1 a través de la vena de la cola, y luego 8 horas después de la inyección.irradiación láser con una longitud de onda de 808 nm.Como se muestra en la Figura 8B, los volúmenes tumorales aumentaron significativamente en los grupos de solución salina y láser, lo que indica que la irradiación con solución salina o láser 808 tuvo poco efecto sobre el crecimiento tumoral.Al igual que en el grupo de solución salina, también se observó un rápido crecimiento tumoral en ratones tratados con RuDA-NP o RuDA en ausencia de irradiación con láser, lo que demuestra su baja toxicidad en la oscuridad.Por el contrario, después de la irradiación con láser, tanto el tratamiento con RuDA-NP como con RuDA indujeron una regresión tumoral significativa con reducciones del volumen tumoral del 95,2 % y el 84,3 %, respectivamente, en comparación con el grupo tratado con solución salina, lo que indica una TFD sinérgica excelente., mediada por el efecto RuDA/CHTV.– NP u Ore. En comparación con RuDA, las RuDA NP mostraron un mejor efecto fototerapéutico, que se debió principalmente al efecto EPR de las RuDA NP.Los resultados de inhibición del crecimiento tumoral se evaluaron adicionalmente por el peso del tumor extirpado el día 15 de tratamiento (Fig. 8C y Fig. 33 complementaria).La masa tumoral media en los ratones tratados con RuDA-NP y los ratones tratados con RuDA fue de 0,08 y 0,27 g, respectivamente, mucho más ligera que en el grupo de control (1,43 g).
Además, se registró el peso corporal de los ratones cada tres días para estudiar la toxicidad en la oscuridad de RuDA-NP o RuDA in vivo.Como se muestra en la Figura 8D, no se observaron diferencias significativas en el peso corporal para todos los grupos de tratamiento. Además, se llevó a cabo la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) de diferentes grupos de tratamiento. Además, se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) de diferentes grupos de tratamiento. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Además, se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmones y riñones) de diferentes grupos de tratamiento.(H&E) 染色 (ÉL) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Además, se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de los órganos principales (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) en diferentes grupos de tratamiento.Como se muestra en la figura.8E, las imágenes de tinción H&E de cinco órganos principales de los grupos RuDA-NP y RuDA no muestran anomalías obvias ni daños en los órganos. 8E, las imágenes de tinción H&E de cinco órganos principales de los grupos RuDA-NP y RuDA no muestran anomalías obvias ni daños en los órganos.Como se muestra en la fig.8e, изображения орашиваниís h & e п destr cualquiera оновных оаанов из групп. 8E, las imágenes de tinción H&E de cinco órganos principales de los grupos RuDA-NP y RuDA no muestran anomalías o lesiones evidentes en los órganos.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官损〟〟如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8e, изображениís орашиваниís h & e пяяanque оновых ыхtamente пн пи °. Como se muestra en la Figura 8E, las imágenes de tinción H&E de los cinco órganos principales de los grupos RuDA-NP y RuDA no mostraron anomalías obvias ni daños en los órganos.Estos resultados mostraron que ni RuDA-NP ni RuDA mostraron signos de toxicidad in vivo. Además, las imágenes de tumores con tinción H&E mostraron que los grupos RuDA + Laser y RuDA-NPs + Laser podían causar una destrucción grave de células cancerosas, lo que demuestra la excelente eficacia fototerapéutica in vivo de RuDA y RuDA-NPs. Además, las imágenes de tumores con tinción H&E mostraron que los grupos RuDA + Laser y RuDA-NPs + Laser podían causar una destrucción grave de células cancerosas, lo que demuestra la excelente eficacia fototerapéutica in vivo de RuDA y RuDA-NPs.Además, las imágenes tumorales teñidas con hematoxilina-eosina mostraron que los grupos RuDA+Laser y RuDA-NPs+Laser pueden inducir una destrucción severa de las células cancerosas, lo que demuestra la eficacia fototerapéutica superior de RuDA y RuDA-NPs in vivo.此外 ， 肿瘤 的 H&E 染色 图像 显示 ， ruda + láser 和 ruda-nps + láser 组均 可 严重 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 优异 体内 光疗 功效。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 功效 eléctrica eléctrica此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ruda + láser 和 ruda-nps + láser 组均 导致 的 癌 细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 光疗 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。Además, las imágenes tumorales teñidas con hematoxilina y eosina mostraron que los grupos RuDA+Láser y RuDA-NPs+Láser provocaron una destrucción severa de las células cancerosas, lo que demuestra una eficacia fototerapéutica superior de RuDA y RuDA-NPs in vivo.
En conclusión, el complejo organometálico Ru(II)-areno (RuDA) con ligandos de tipo DA fue diseñado para facilitar el proceso de ISC utilizando el método de agregación.La RuDA sintetizada puede autoensamblarse a través de interacciones no covalentes para formar sistemas supramoleculares derivados de RuDA, lo que facilita la formación de 1O2 y la conversión fototérmica eficiente para la terapia del cáncer inducida por la luz.Es de destacar que RuDA monomérico no generó 1O2 bajo irradiación láser a 808 nm, pero podría generar una gran cantidad de 1O2 en estado agregado, lo que demuestra la racionalidad y eficiencia de nuestro diseño.Estudios posteriores han demostrado que el ensamblaje supramolecular dota a RuDA de propiedades fotofísicas y fotoquímicas mejoradas, como la absorción del corrimiento al rojo y la resistencia al fotoblanqueo, que son muy deseables para el procesamiento de PDT y PTT.Experimentos tanto in vitro como in vivo han demostrado que las RuDA NP con buena biocompatibilidad y buena acumulación en el tumor exhiben una excelente actividad anticancerígena inducida por la luz tras la irradiación con láser a una longitud de onda de 808 nm.Por lo tanto, las RuDA NP como reactivos PDT/PTW supramoleculares bimodales efectivos enriquecerán el conjunto de fotosensibilizadores activados a longitudes de onda superiores a 800 nm.El diseño conceptual del sistema supramolecular proporciona una ruta eficiente para los fotosensibilizadores activados por NIR con excelentes efectos fotosensibilizadores.
Todos los productos químicos y disolventes se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional.RuCl3 se adquirió de Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, China).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-diona) y 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 El ,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol se sintetizó de acuerdo con estudios previos64,65.Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III-HD de 600 MHz en el Centro de Pruebas Analíticas de la Universidad Southeastern usando d6-DMSO o CDCl3 como solvente.Los desplazamientos químicos δ se dan en ppm.con respecto al tetrametilsilano, y las constantes de interacción J se dan en valores absolutos en hercios.La espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) se realizó en un instrumento Agilent 6224 ESI/TOF MS.El análisis elemental de C, H y N se realizó en un analizador elemental Vario MICROCHNOS (Elementar).Los espectros UV-visible se midieron en un espectrofotómetro Shimadzu UV3600.Los espectros de fluorescencia se registraron en un espectrofluorímetro Shimadzu RF-6000.Los espectros EPR se registraron en un instrumento Bruker EMXmicro-6/1.La morfología y estructura de las muestras preparadas se estudió en instrumentos FEI Tecnai G20 (TEM) y Bruker Icon (AFM) operando a un voltaje de 200 kV.La dispersión de luz dinámica (DLS) se realizó en un analizador Nanobrook Omni (Brookhaven).Las propiedades fotoelectroquímicas se midieron en una configuración electroquímica (CHI-660, China).Las imágenes fotoacústicas se obtuvieron utilizando el sistema FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Las imágenes confocales se obtuvieron utilizando un microscopio confocal Olympus FV3000.El análisis FACS se realizó en un citómetro de flujo BD Calibur.Los experimentos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se realizaron en un sistema Waters Alliance e2695 utilizando un detector UV/Vis 2489.Las pruebas de cromatografía de permeación en gel (GPC) se registraron en un instrumento Thermo ULTIMATE 3000 utilizando un detector de índice de refracción ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolina-5,6-diona)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) y ácido acético glacial (30 ml) se agitaron en un refrigerador a reflujo durante 12 horas.A continuación, el disolvente se eliminó al vacío utilizando un evaporador rotatorio.El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gel de sílice, CH2Cl2:MeOH = 20:1) para obtener RuDA como un polvo verde (rendimiento: 877,5 mg, 80%).ano.Calculado para C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Encontrado: C 67.92, H 4.26, N 9.82.RMN 1H (600 MHz, d6-DMSO) δ 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), δ (ppm) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 10.819. , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Síntesis de 4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol (L2): L2 se sintetizó en dos pasos.Se añadió Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) a N,N-dietil-4-(tributilestannil)anilina (1,05 g, 2,4 mmol) y solución de 4,7-dibromo-5,6-dinitro - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) en tolueno seco (100 ml).La mezcla se agitó a 100°C durante 24 horas.Después de eliminar el tolueno al vacío, el sólido resultante se lavó con éter de petróleo.Luego, una mezcla de este compuesto (234,0 mg, 0,45 mmol) y polvo de hierro (0,30 g, 5,4 mmol) en ácido acético (20 ml) se agitó a 80ºC durante 4 horas.La mezcla de reacción se vertió en agua y el sólido pardo resultante se recogió por filtración.El producto se purificó dos veces por sublimación al vacío para dar un sólido verde (126,2 mg, 57 % de rendimiento).ano.Calculado para C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Encontrado: C 67.84, H 6.95, H 18.16.RMN 1H (600 MHz, CDCl3), δ (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).RMN de 13С (150 MHz, CDCl3), δ (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-EM: m/z [M+H]+ = 461,24.
Los compuestos se prepararon y purificaron siguiendo procedimientos similares a RuDA.ano.Calculado para C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Encontrado: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, RMN 1H (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), δ (ppm) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76, 105.07, 104.23., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA se disolvió en MeOH/H2O (5/95, v/v) a una concentración de 10 μM.El espectro de absorción de RuDA se midió cada 5 minutos en un espectrofotómetro Shimadzu UV-3600 bajo irradiación con luz láser con una longitud de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).Los espectros ICG se registraron en las mismas condiciones que el estándar.
Los espectros EPR se registraron en un espectrómetro Bruker EMXmicro-6/1 con una potencia de microondas de 20 mW, un rango de exploración de 100 G y una modulación de campo de 1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidona (TEMP) y N-óxido de 5,5-dimetil-1-pirrolina (DMPO) se utilizaron como trampas giratorias.Se registraron espectros de resonancia de espín electrónico para soluciones mixtas de RuDA (50 µM) y TEMF (20 mM) o DMPO (20 mM) bajo la acción de radiación láser con una longitud de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).
Los cálculos de DFT y TD-DFT para RuDA se realizaron a niveles de PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ en solución acuosa utilizando el programa gaussiano 1666,67,68.Las distribuciones de HOMO-LUMO, huecos y electrones del estado excitado de singlete de baja energía RuDA se trazaron utilizando el programa GaussView (versión 5.0).
Primero intentamos medir la eficiencia de generación de 1O2 RuDA usando espectroscopía UV-visible convencional con ICG (ΦΔ = 0.002) como estándar, pero la fotodegradación de ICG afectó fuertemente los resultados.Por lo tanto, el rendimiento cuántico de 1O2 RuDA se midió detectando un cambio en la intensidad de la fluorescencia ABDA a aproximadamente 428 nm cuando se irradió con un láser con una longitud de onda de 808 nm (0,5 W/cm2).Los experimentos se realizaron en RuDA y RuDA NP (20 μM) en agua/DMF (98/2, v/v) que contenía ABDA (50 μM).El rendimiento cuántico de 1O2 se calculó utilizando la siguiente fórmula: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS y rICG son las velocidades de reacción de ABDA con 1O2 obtenidas del fotosensibilizador e ICG, respectivamente.APS y AICG son la absorbancia del fotosensibilizador e ICG a 808 nm, respectivamente.
Las mediciones de AFM se llevaron a cabo en condiciones líquidas utilizando el modo de exploración en un sistema Bruker Dimension Icon AFM.Usando una estructura abierta con células líquidas, las células se lavaron dos veces con etanol y se secaron con una corriente de nitrógeno.Inserte las células secas en la cabeza óptica del microscopio.Inmediatamente coloque una gota de la muestra en el charco de líquido y colóquelo en el voladizo con una jeringa de plástico desechable estéril y una aguja estéril.Se coloca otra gota directamente sobre la muestra, y cuando se baja el cabezal óptico, las dos gotas se fusionan, formando un menisco entre la muestra y el depósito de líquido.Las mediciones de AFM se llevaron a cabo utilizando un voladizo de nitruro en forma de V SCANASYST-FLUID (Bruker, dureza k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
Los cromatogramas de HPLC se obtuvieron en un sistema Waters e2695 equipado con una columna Phoenix C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) utilizando un detector UV/Vis 2489.La longitud de onda del detector es de 650 nm.Las fases móviles A y B fueron agua y metanol, respectivamente, y el caudal de la fase móvil fue de 1,0 ml·min-1.El gradiente (disolvente B) fue el siguiente: 100 % de 0 a 4 minutos, 100 % a 50 % de 5 a 30 minutos y reinicio al 100 % de 31 a 40 minutos.El mineral se disolvió en una solución mixta de metanol y agua (50/50, por volumen) a una concentración de 50 μM.El volumen de inyección fue de 20 μl.
Los ensayos de GPC se registraron en un instrumento Thermo ULTIMATE 3000 equipado con dos columnas PL aquagel-OH MIXED-H (2 × 300 × 7,5 mm, 8 µm) y un detector de índice de refracción ERC RefratoMax520.La columna de GPC se eluyó con agua a un caudal de 1 ml/min a 30°C.Las NP de mineral se disolvieron en una solución de PBS (pH = 7,4, 50 μM), el volumen de inyección fue de 20 μL.
Las fotocorrientes se midieron en una configuración electroquímica (CHI-660B, China).Las respuestas optoelectrónicas al encender y apagar el láser (808 nm, 0,5 W/cm2) se midieron a un voltaje de 0,5 V en una caja negra, respectivamente.Se utilizó una celda estándar de tres electrodos con un electrodo de carbono vítreo (GCE) en forma de L como electrodo de trabajo, un electrodo de calomelano estándar (SCE) como electrodo de referencia y un disco de platino como contraelectrodo.Como electrolito se utilizó una solución de Na2SO4 0,1 M.
La línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se adquirió de KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, China, número de catálogo: KG033).Las células se cultivaron en monocapas en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, glucosa alta) complementado con una solución de suero fetal bovino (FBS) al 10 %, penicilina (100 μg/ml) y estreptomicina (100 μg/ml).Todas las células se cultivaron a 37°C en una atmósfera húmeda que contenía 5% de CO2.
El ensayo MTT se utilizó para determinar la citotoxicidad de RuDA y RuDA-NP en presencia y ausencia de irradiación de luz, con o sin Vc (0,5 mM).Se cultivaron células cancerosas MDA-MB-231 en placas de 96 pocillos a una densidad celular de aproximadamente 1 x 105 células/ml/pocillo y se incubaron durante 12 horas a 37,0 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 y 95 % de aire.Se añadieron a las células RuDA y RuDA NP disueltas en agua.Después de 12 horas de incubación, las células se expusieron a radiación láser de 0,5 W cm -2 a una longitud de onda de 808 nm durante 10 minutos (300 J cm -2) y luego se incubaron en la oscuridad durante 24 horas.A continuación, las células se incubaron con MTT (5 mg/ml) durante otras 5 horas.Finalmente, cambie el medio a DMSO (200 l) para disolver los cristales de formazán púrpura resultantes.Los valores de DO se midieron utilizando un lector de microplacas con una longitud de onda de 570/630 nm.El valor de IC50 para cada muestra se calculó utilizando el software SPSS a partir de las curvas de respuesta a la dosis obtenidas de al menos tres experimentos independientes.
Las células MDA-MB-231 se trataron con RuDA y RuDA-NP a una concentración de 50 μM.Después de 12 horas de incubación, las células se irradiaron con un láser de 808 nm de longitud de onda y una potencia de 0,5 W/cm2 durante 10 min (300 J/cm2).En el grupo de vitamina C (Vc), las células se trataron con Vc 0,5 mM antes de la irradiación con láser.Luego, las células se incubaron en la oscuridad durante 24 horas adicionales, luego se tiñeron con calceína AM y yoduro de propidio (20 μg/ml, 5 μl) durante 30 minutos, luego se lavaron con PBS (10 μl, pH 7,4).imágenes de células teñidas.