Noticias

Gracias por visitar Nature.com.La versión del navegador que está utilizando tiene compatibilidad limitada con CSS.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador actualizado (o deshabilite el modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, mostraremos el sitio sin estilos ni JavaScript.
Los métodos de marcaje de proximidad enzimático basados ​​en ésteres activados o radicales fenoxi son ampliamente utilizados para mapear proteomas subcelulares e interactuadores de proteínas en células vivas.Sin embargo, los ésteres activados son menos reactivos, lo que da como resultado un amplio radio de marcaje, y los radicales fenoxi generados por el tratamiento con peróxido pueden interferir con las vías redox.Aquí informamos un método de fotoactivación dependiente del etiquetado de proximidad (PDPL) desarrollado al vincular genéticamente la proteína fotosensibilizadora miniSOG a una proteína de interés.Activado por la luz azul y controlado por el tiempo de exposición, se genera oxígeno singulete y luego se logra el marcaje de residuos de histidina resuelto espaciotemporalmente por la sonda de anilina.Demostramos su alta fidelidad a través del mapeo de proteomas específicos de orgánulos.Una comparación lado a lado de PDPL con TurboID muestra una cobertura proteómica más específica y completa de PDPL.A continuación, aplicamos PDPL al coactivador transcripcional asociado a la enfermedad BRD4 y E3 Parkin ligase y encontramos interactores previamente desconocidos.Mediante el cribado de sobreexpresión, se identificaron dos sustratos desconocidos, Ssu72 y SNW1, para Parkin, cuya degradación está mediada por la vía de ubiquitinación-proteasoma.
La caracterización precisa de las redes de proteínas es la base de muchos procesos celulares fundamentales.Por lo tanto, el mapeo espaciotemporal de alta precisión de las interacciones de proteínas proporcionará una base molecular para descifrar las vías biológicas, la patología de la enfermedad y la interrupción de estas interacciones con fines terapéuticos.Con este fin, son muy deseables métodos capaces de detectar interacciones temporales en células o tejidos vivos.Históricamente, la espectrometría de masas de purificación por afinidad (AP-MS) se ha utilizado para identificar socios de unión de proteínas de interés (POI).Con el desarrollo de métodos de proteómica cuantitativa, se creó Bioplex3.0, la mayor base de datos de redes de proteínas basadas en AP-MS.Aunque AP-MS es muy potente, los pasos de dilución y lisis celular en el flujo de trabajo están sesgados hacia interacciones de unión débiles y transitorias e introducen artefactos posteriores a la lisis, como pares de interacciones espurias que carecen de compartimentación antes de la lisis.
Para abordar estos problemas, se han desarrollado aminoácidos no naturales (UAA) con grupos de entrecruzamiento y plataformas de etiquetado cercano enzimático (PL) (p. ej., APEX y BioID)5.Aunque el método UAA se ha aplicado con éxito en muchos escenarios y proporciona información sobre adhesivos proteicos directos, aún se requiere la optimización del sitio de inserción de UAA.Más importante aún, es un método de marcaje estequiométrico que carece de una reversión catalítica de los eventos de marcaje.Por el contrario, los métodos enzimáticos de PL, como el método BioID, fusionan la ligasa de biotina modificada con POI7, que posteriormente activa la biotina para formar un intermedio de éster de biotinilo-AMP reactivo.Por lo tanto, la enzima cataliza y libera una “nube” de biotina activada que marca los residuos de lisina proximales.Sin embargo, BioID requiere más de 12 horas para obtener una señal etiquetada suficiente, lo que impide su uso con resolución temporal.Utilizando evolución dirigida basada en visualización de levadura, TurboID fue diseñado basado en BioID para ser más eficiente, permitiendo un etiquetado eficiente con biotina en 10 minutos, lo que permite estudiar procesos más dinámicos.Debido a que TurboID es altamente activo y los niveles de biotina endógena son suficientes para el marcaje de bajo nivel, el marcaje de fondo se convierte en un problema potencial cuando se requiere un marcaje altamente mejorado y sincronizado mediante la adición de biotina exógena.Además, los ésteres activados son poco reactivos (t1/2 ~5 min), lo que puede dar lugar a un gran radio de marcaje, especialmente después de la saturación de las proteínas vecinas con biotina 5. En otro enfoque, la fusión genética de ascorbato peroxidasa modificada (es decir, biotina- radicales fenol y permite el etiquetado de proteínas en un minuto 9, 10. APEX se usa ampliamente para identificar proteomas subcelulares, complejos de proteínas de membrana y complejos de proteínas de señalización citosólica 11, 12. Sin embargo, la necesidad de altas concentraciones de peróxidos puede afectar las proteínas o vías redox, interrumpiendo procesos celulares.
Por lo tanto, un nuevo método capaz de generar especies de supresión de radio marcado más reactivas con alta precisión espacial y temporal sin alterar significativamente las vías celulares será una adición importante a los métodos existentes. Entre las especies reactivas, el oxígeno singlete despertó nuestra atención debido a su corta vida útil y radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 µs en las células)13. Entre las especies reactivas, el oxígeno singlete despertó nuestra atención debido a su corta vida útil y radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 µs en las células)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Entre las formas activas, el oxígeno singlete atrajo nuestra atención debido a su corta vida útil y su radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 µs en las células)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Entre las formas activas, el oxígeno singlete atrae nuestra atención debido a su corta vida útil y radio de difusión limitado (t1/2 < 0,6 μs en las células).Se ha informado que el oxígeno singlete oxida aleatoriamente la metionina, la tirosina, la histidina y el triptófano, haciéndolo polar 14,15 para la unión a sondas basadas en aminas o tiol16,17.Aunque el oxígeno singulete se ha utilizado para etiquetar el ARN del compartimento subcelular, las estrategias para reutilizar los marcadores de proximidad de POI endógenos siguen sin explorarse.Aquí, presentamos una plataforma llamada etiquetado de proximidad dependiente de la fotoactivación (PDPL), en la que usamos luz azul para iluminar puntos de interés fusionados con un fotosensibilizador miniSOG y activamos la generación de oxígeno singulete para oxidar los residuos proximales, seguido de modificaciones que contienen aminas para oxidar las sondas químicas en células vivas intermedias..Probamos un grupo de sondas químicas para maximizar la especificidad de las etiquetas e identificamos sitios de modificación utilizando un flujo de trabajo de proteómica abierta.Una comparación lado a lado de PDPL con TurboID muestra una cobertura proteómica más específica y completa de PDPL.Aplicamos este enfoque a los marcadores específicos de orgánulos del proteoma subcelular y la identificación general del proteoma de los socios de unión para la proteína reguladora epigenética asociada al cáncer BRD4 y la E3 ligasa Parkin asociada a la enfermedad de Parkinson, que confirmó una red conocida y desconocida de proteínas. interacciones..La capacidad de PDPL para reconocer sustratos E3 en grandes complejos de proteínas representa una situación en la que se requiere el reconocimiento de aglutinantes indirectos.Se han confirmado in situ dos sustratos de parkina desconocidos mediados por ubiquitinación-proteasoma.
La terapia fotodinámica (PDT)19 y la inactivación con láser asistida por cromóforos (CALI)20, en las que la irradiación de luz con fotosensibilizadores genera oxígeno singulete, puede inactivar proteínas diana o provocar la muerte celular.Dado que el oxígeno singlete es una sustancia altamente reactiva con una distancia de difusión teórica de aproximadamente 70 nm, se puede controlar la oxidación espacialmente limitada alrededor del fotosensibilizador.Basándonos en este concepto, decidimos utilizar oxígeno singlete para lograr un etiquetado cercano de los complejos de proteínas en las células vivas.Hemos desarrollado un enfoque quimioproteómico de PDPL para cumplir cuatro funciones: (1) catalizar la generación de oxígeno singulete activo similar al enfoque enzimático de PL;(2) proporcionar un etiquetado resuelto en el tiempo tras el inicio de la luz;(3) por alteración (4) Evite el uso de cofactores endógenos (como la biotina) para reducir el fondo, o use reactivos exógenos altamente perturbadores (como los peróxidos) para minimizar la exposición celular al estrés ambiental.
Los fotosensibilizadores se pueden dividir en dos categorías, incluidos los fluoróforos de peso molecular pequeño (p. ej., rosa de bengala, azul de metileno)22 y proteínas pequeñas codificadas genéticamente (p. ej., miniSOG, KillerRed)23.Para lograr un diseño modular, desarrollamos la plataforma PDPL de primera generación agregando proteínas fotosensibilizadoras (PS) a POI24,25 (Figura 1a).Cuando se irradia con luz azul, el oxígeno singulete oxida los residuos de aminoácidos nucleofílicos proximales, lo que da como resultado una polaridad unpolung que es electrofílica y puede reaccionar aún más con los nucleófilos de sonda de amina16,17.La sonda está diseñada con un mango de alquino para permitir la química de clic y tirar hacia abajo para la caracterización LC/MS/MS.
Ilustración esquemática del etiquetado de complejos proteicos mediados por miniSOG.Cuando se exponen a la luz azul, las células que expresan miniSOG-POI generan oxígeno singulete, que modifica las proteínas que interactúan pero no las proteínas que no se unen.Los productos intermedios de la fotooxidación son interceptados por etiquetas de relé de la sonda química de amina para formar aductos covalentes.El grupo alquinilo en la sonda química permite hacer clic en la química para el enriquecimiento mediante extracción seguida de cuantificación LC-MS/MS.b Estructura química de las sondas de amina 1-4.c Análisis de gel fluorescente representativo de marcadores proteómicos mediados por miniSOG localizados mitocondriales usando las sondas 1-4 y cuantificación relativa basada en densitometría en gel.La relación señal/fondo de las sondas químicas se evaluó mediante experimentos de control negativo que excluyeron la luz azul o mediante el uso de células HEK293T sin expresión miniSOG.n = 2 muestras biológicamente independientes.Cada punto representa una réplica biológica.d Detección y cuantificación representativas de PDPL usando la sonda optimizada 3 en presencia o ausencia de los componentes de PDPL indicados como c.n = 3 muestras biológicamente independientes.Cada punto representa una réplica biológica.Las líneas centrales y los bigotes representan la media y la desviación estándar ±.CBB: azul brillante de Coomassie.e Imágenes confocales de oxígeno singulete con tinción Si-DMA de rojo lejano.Barra de escala: 10 µm.Los experimentos confocales y de formación de imágenes en gel se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares.
Primero probamos la capacidad de los fotosensibilizadores maduros miniSOG26 y KillerRed23, expresados ​​​​establemente en HEK293T, para mediar en el etiquetado de propargilamina del proteoma como una sonda química (Fig. 1a complementaria).El análisis de fluorescencia en gel mostró que el etiquetado del proteoma completo se logró utilizando miniSOG e irradiación con luz azul, mientras que no se observó ningún producto de etiquetado visible con KillerRed.Para mejorar la relación señal-fondo, probamos un conjunto de sondas químicas que contenían anilina (1 y 3), propilamina (2) o bencilamina (4).Observamos que las propias células HEK293T tenían una señal de fondo más alta en comparación con la ausencia de luz azul, posiblemente debido al fotosensibilizador endógeno de riboflavina, el mononucleótido de flavina (FMN) 27 . Las sondas químicas 1 y 3 basadas en anilina dieron una mejor especificidad, con HEK293T expresando miniSOG de forma estable en las mitocondrias mostrando un aumento de >8 veces en la señal para la sonda 3, mientras que la sonda 2 utilizada en el método de etiquetado de ARN CAP-seq solo mostró ~2.5- aumento de la señal de veces, probablemente debido a las diferentes preferencias de reactividad entre el ARN y la proteína (Fig. 1b, c). Las sondas químicas 1 y 3 basadas en anilina dieron una mejor especificidad, con HEK293T expresando miniSOG de forma estable en las mitocondrias mostrando un aumento de >8 veces en la señal para la sonda 3, mientras que la sonda 2 utilizada en el método de etiquetado de ARN CAP-seq solo mostró ~2.5- aumento de la señal de veces, probablemente debido a las diferentes preferencias de reactividad entre el ARN y la proteína (Fig. 1b, c).Las sondas químicas 1 y 3 basadas en anilina mostraron una mayor especificidad: HEK293T, que expresa miniSOG de manera estable en las mitocondrias, muestra un aumento de más de 8 veces en la señal para la sonda 3, mientras que la sonda 2, utilizada en el método de marcaje de ARN CAP-seq, solo muestra un aumento de la señal de ~ 2,5 veces, probablemente debido a las diferentes preferencias de reactividad entre el ARN y la proteína (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 Minisog ， 探针 3 的 信号> 8 倍 ， 而 用 于 于 标记 方法 方法 Cap-seq 的 探针 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于ARN 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 Minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 ARN 标记 CAP-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ 2.5 - 倍信号增加，可能是由于ARNLas sondas químicas 1 y 3 basadas en anilina tenían una mejor especificidad, HEK293T expresó miniSOG de forma estable en las mitocondrias, y la sonda 3 tuvo un aumento de más de 8 veces en la señal, mientras que la sonda 2 para el método de etiquetado de ARN CAP-seq mostró solo un aumento de ~2,5 veces.en la señal, probablemente debido a las diferentes preferencias de reacción entre el ARN y la proteína (Fig. 1b, c).Además, se probaron los isómeros de la sonda 3 y las sondas de hidrazina (sondas 5, 6, 7), lo que confirmó la optimización de la sonda 3 (Fig. 1b, c complementaria).De manera similar, el análisis de fluorescencia en gel reveló otros parámetros experimentales optimizados: longitud de onda de irradiación (460 nm), concentración de sonda química (1 mM) y tiempo de irradiación (20 min) (Fig. 2a-c complementaria).La omisión de cualquier componente o paso en el protocolo PDPL resultó en una inversión significativa de la señal al fondo (Fig. 1d).En particular, el marcaje de proteínas se redujo significativamente en presencia de azida de sodio o trolox, que se sabe que eliminan el oxígeno singulete.La presencia de D2O, que se sabe que estabiliza el oxígeno singulete, mejora la señal de marcaje.Para investigar la contribución de otras especies reactivas de oxígeno al etiquetado, se agregaron manitol y vitamina C para establecer eliminadores de radicales hidroxilo y superóxido, respectivamente, 18, 29, pero no se encontró que reduzcan el etiquetado.La adición de H2O2, pero no la iluminación, no resultó en el etiquetado (Fig. 3a complementaria).Las imágenes de oxígeno singulete de fluorescencia con sondas Si-DMA confirmaron la presencia de oxígeno singulete en el cable HEK293T-miniSOG, pero no en el cable HEK293T original.Además, mitoSOX Red no pudo detectar la producción de superóxido después de la iluminación (Fig. 1e y Fig. 3b complementaria) 30. Estos datos sugieren fuertemente que el oxígeno singulete es la principal especie de oxígeno reactivo responsable del posterior etiquetado proteómico.Se evaluó la citotoxicidad de PDPL, incluida la irradiación de luz azul y las sondas químicas, y no se observó una citotoxicidad significativa (Fig. 4a complementaria).
Para estudiar el mecanismo de etiquetado y permitir la identificación proteómica de los complejos de proteínas mediante LC-MS/MS, primero debemos determinar qué aminoácidos se modifican y la masa delta de las etiquetas de sonda.Se ha informado que la metionina, la histidina, el triptófano y la tirosina son modificados por el oxígeno singlete14,15.Integramos el flujo de trabajo TOP-ABPP31 con la búsqueda abierta imparcial proporcionada por la plataforma informática FragPipe basada en MSFragger32.Después de la modificación del oxígeno singulete y el etiquetado de la sonda química, se realizó la química del clic utilizando una etiqueta de reducción de biotina que contenía un enlazador escindible, seguida de estiramiento con neutravidina y digestión con tripsina.El péptido modificado, aún unido a la resina, se fotoescindió para el análisis LC-MS/MS (Figura 2a y Datos complementarios 1).Se produjo una gran cantidad de modificaciones en todo el proteoma con más de 50 coincidencias de mapas de péptidos (PSM) enumeradas (Fig. 2b).Sorprendentemente, solo observamos la modificación de la histidina, probablemente debido a la mayor reactividad de la histidina oxidada hacia las sondas de anilina que otros aminoácidos.De acuerdo con el mecanismo publicado de oxidación de histidina por oxígeno singlete,21,33 la estructura delta-masa propuesta de +229 Da corresponde al aducto de la sonda 3 con 2-oxo-histidina después de dos oxidaciones, mientras que +247 Da es el producto de hidrólisis de +229 Da (Fig. 5 complementaria).La evaluación del espectro MS2 mostró una alta confiabilidad de identificación de la mayoría de los iones y y b, incluida la identificación de iones de fragmentos modificados (y y b) (Fig. 2c).El análisis de contexto de la secuencia local de histidinas modificadas con PDPL reveló una preferencia de motivo moderada por pequeños residuos hidrofóbicos en posiciones ± 1 (Fig. 4b complementaria).En promedio, se identificaron 1.4 histidinas por proteína, y los sitios de estos marcadores se determinaron mediante el análisis del área de superficie accesible al solvente (SASA) y la disponibilidad relativa del solvente (RSA) (Fig. 4c, d complementaria).
Un flujo de trabajo imparcial para estudiar la selectividad residual utilizando la plataforma informática FragPipe con tecnología de MSFragger.Los enlazadores escindibles se utilizan en la química Click para permitir la fotoescisión de péptidos modificados de la resina de estreptavidina.Se inició una búsqueda abierta para identificar numerosas modificaciones, así como restos relevantes.b Asigne la masa de modificaciones que ocurren a lo largo del proteoma.Mapeo de péptidos PSM.c Anotación espectral de MS2 de los sitios de histidina modificados con la sonda 3. Como ejemplo representativo, una reacción covalente con la sonda 3 agregó +229,0938 Da al aminoácido modificado.d Ensayo de mutación utilizado para probar los marcadores de PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) y PRDX1 (H10A, H81A, H169A) se transfectaron con plásmidos de tipo salvaje para la detección anti-Flag.e El péptido sintético se hizo reaccionar con miniSOG purificado en presencia de la sonda 3 y los productos correspondientes con Δm +247 y +229 se observaron en el espectro de LC-MS.f Interacciones de proteína a proteína in vitro modeladas con miniSOG-6xHis-tag y anticuerpo anti-6xHis.Antibiotina (estreptavidina-HRP) y análisis de Western blot anti-ratón de complejos de anticuerpos miniSOG-6xHis/anti-6xHis marcados con la sonda 3, según el tiempo de exposición a la luz.Las etiquetas para proteínas individuales se expresan en el peso molecular correspondiente: cadena ligera del anticuerpo LC, cadena pesada del anticuerpo HC.Estos experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares.
Para la verificación bioquímica del sitio de marcaje, PRDX3 y PRDX1 identificados por espectrometría de masas se cambiaron de histidina a alanina y se compararon con el tipo salvaje en ensayos de transfección.Los resultados de PDPL mostraron que la mutación redujo significativamente el etiquetado (Fig. 2d).Mientras tanto, las secuencias peptídicas identificadas en la búsqueda abierta se sintetizaron y reaccionaron in vitro con miniSOG purificado en presencia de la sonda 3 y luz azul, produciendo productos con un cambio de masa de +247 y +229 Da cuando se detectaron por LC-MS (Fig. 2e).).Para probar si las proteínas proximales que interactúan podrían etiquetarse in vitro en respuesta a la fotoactivación de miniSOG, diseñamos un ensayo de proximidad artificial mediante la interacción entre la proteína miniSOG-6xHis y un anticuerpo monoclonal anti-His in vitro (Figura 2f).En este ensayo, esperábamos el etiquetado proximal de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo con miniSOG.De hecho, las transferencias de Western anti-ratón (que reconocen las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo marcado con anti-6xHis) y estreptavidina mostraron una fuerte biotinilación de las cadenas pesadas y ligeras.En particular, notamos la autobiotinilación de miniSOG debido a la etiqueta 6xHis y los enlaces cruzados entre las cadenas ligera y pesada, que pueden estar relacionados con la brecha descrita anteriormente entre la respuesta proximal de lisina y 2-oxo-histidina.En conclusión, concluimos que PDPL modifica la histidina de manera dependiente de la proximidad.
Nuestro siguiente objetivo fue caracterizar el proteoma subcelular para probar la especificidad del etiquetado in situ.Por lo tanto, expresamos miniSOG de manera estable en el núcleo, la matriz mitocondrial o la membrana ER externa de las células HEK293T (Fig. 3a).El análisis de fluorescencia en gel reveló abundantes bandas etiquetadas en tres ubicaciones subcelulares, así como diferentes patrones de etiquetado (Fig. 3b).El análisis de imágenes de fluorescencia mostró una alta especificidad de PDPL (Fig. 3c).El flujo de trabajo de PDPL fue seguido por reacciones de clic con tintes de rodamina para delinear proteomas subcelulares mediante microscopía de fluorescencia, y las señales de PDPL se colocalizaron con DAPI, rastreadores mitocondriales o rastreadores ER, lo que confirma la alta fidelidad de PDPL.Para las tres ubicaciones de orgánulos, una comparación lado a lado de PDPL con TurboID usando avidina western blot mostró que PDPL estaba etiquetado más específicamente en comparación con sus respectivos controles.En condiciones de PDPL, aparecieron más bandas marcadas, lo que indica más proteínas marcadas con PDPL (Fig. 6a-d complementaria).
a Representación esquemática del etiquetado de proteoma específico de orgánulos mediado por miniSOG.miniSOG se dirige a la matriz mitocondrial a través de la fusión con los 23 aminoácidos N-terminales de la COX4 humana (mito-miniSOG), el núcleo a través de la fusión con H2B (núcleo-miniSOG) y Sec61β a través del lado citoplásmico de la membrana ER (ER-miniSOG ).Las indicaciones incluyen imágenes en gel, imágenes confocales y espectrometría de masas.b Imágenes de gel representativas de tres perfiles de PDPL específicos de orgánulos.Azul brillante CBB Coomassie.c Imágenes confocales representativas de células HEK293T que expresan miniSOG de forma estable con diferentes localizaciones subcelulares detectadas por V5 marcado con anticuerpo (rojo).Los marcadores subcelulares se utilizan para mitocondrias y ER (verde).El flujo de trabajo de PDPL incluye la detección de proteomas subcelulares marcados con miniSOG (amarillo) mediante la química de clics Cy3-azide.Barra de escala: 10 µm.d Gráficas volcánicas de proteomas etiquetados con PDPL en varios orgánulos cuantificados mediante cuantificación sin etiquetar (n = 3 experimentos biológicos independientes).Se utilizó la prueba t de Student de dos colas en gráficos de volcanes.Se usó HEK293T de tipo salvaje como control negativo. Las proteínas significativamente modificadas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia de intensidad de iones). Las proteínas significativamente modificadas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia de intensidad de iones). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Las proteínas significativamente alteradas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia en la intensidad de los iones).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Las proteínas significativamente alteradas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia en la fuerza iónica).Las proteínas relacionadas importantes para HEK293T-miniSOG pero no importantes para HEK293T se muestran en verde.e Análisis de la especificidad de conjuntos de datos proteómicos de experimentos d.El número total de proteínas estadísticamente significativas en cada orgánulo (puntos rojos y verdes) está marcado en la parte superior.Los histogramas muestran proteínas localizadas en orgánulos según MitoCarta 3.0, análisis GO y A. Ting et al.gente.Conjuntos de datos separados para mitocondrias, núcleos y ER.Estos experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares.Los datos sin procesar se proporcionan en forma de archivos de datos sin procesar.
Alentados por los resultados del gel y de las imágenes, se utilizó la cuantificación sin etiquetas para cuantificar el proteoma identificado en cada orgánulo (Datos complementarios 2).Se usó HEK293T no transfectado como control negativo para sustraer los marcadores de fondo. El análisis del gráfico del volcán mostró proteínas significativamente enriquecidas (p < 0,05 y > 2 veces la intensidad de los iones), así como proteínas únicas que solo están presentes en las líneas que expresan miniSOG (Fig. 3d, puntos rojos y verdes). El análisis del gráfico del volcán mostró proteínas significativamente enriquecidas (p < 0,05 y > 2 veces la intensidad de los iones), así como proteínas únicas que solo están presentes en las líneas que expresan miniSOG (Fig. 3d, puntos rojos y verdes). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). El análisis de la gráfica del volcán mostró proteínas significativamente enriquecidas (p<0,05 y >2 veces la intensidad de los iones), así como proteínas individuales que solo están presentes en las líneas que expresan miniSOG (Fig. 3d, puntos rojos y verdes).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （P <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 Minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 图 3d 红色 和 绿色点。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （P <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 Minisog 表达 系 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点 。。。））））））））））））））））））））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). El análisis del gráfico del volcán reveló proteínas significativamente enriquecidas (p<0,05 y >2x fuerza iónica), así como proteínas individuales solo presentes en la línea de expresión miniSOG (puntos rojos y verdes en la Fig. 3d).Combinando estos datos, identificamos 1364, 461 y 911 proteínas de membrana externa nuclear, mitocondrial y ER estadísticamente significativas, respectivamente.Para analizar la precisión del PDPL localizado en orgánulos, utilizamos MitoCarta 3.0, el análisis Gene Ontology (GO) y A. Ting et al.Se usó un conjunto de datos8 para mitocondrias, núcleos y ER para probar la especificidad de los orgánulos de las proteínas detectadas, lo que corresponde a una precisión de 73,4, 78,5 y 73,0% (Fig. 3e).La especificidad de PDPL confirma que PDPL es una herramienta ideal para identificar proteomas específicos de orgánulos.En particular, el análisis de las proteínas mitocondriales identificadas en el análisis submitocondrial mostró que el proteoma atrapado se distribuyó principalmente en la matriz y la membrana interna (226 y 106, respectivamente), lo que representa el 91,7 % (362) del número total de proteínas mitocondriales identificadas.Además, se confirmó un alto nivel de PDPL (Fig. 7a complementaria).De manera similar, el análisis subnuclear mostró que el proteoma capturado se distribuyó principalmente en el núcleo, el nucleoplasma y el nucléolo (Fig. 7b complementaria).El análisis proteómico nuclear con un péptido señal de localización nuclear (3xNLS) mostró una precisión similar a la construcción H2B (Fig. 7c-h complementaria).Para determinar la especificidad del marcador PDPL, se eligió laminina A nuclear como una trampa de POI7 localizada más discretamente.PDPL identificó 36 proteínas significativamente enriquecidas, de las cuales 12 proteínas (30,0% incluida la lamina A) eran proteínas que interactúan con la lamina A bien caracterizadas anotadas por la base de datos String, con un porcentaje más alto que el método BioID (122 proteínas) 28 de 28. , 22,9 %) 7. Nuestro método identificó menos proteínas, posiblemente debido a áreas de marcado limitadas, lo que fue posible gracias a un oxígeno singulete más activo.El análisis GO mostró que las proteínas identificadas se ubicaron principalmente en el nucleoplasma (26), la membrana nuclear (10), la membrana nuclear (9) y los poros nucleares (5).En conjunto, estas proteínas localizadas en el núcleo representaron el 80% de las proteínas enriquecidas, lo que demuestra aún más la especificidad de PDPL (Fig. 8a-d complementaria).
Habiendo establecido la capacidad de PDPL para realizar el marcado de proximidad en orgánulos, luego probamos si PDPL podría usarse para analizar socios de unión de POI.En particular, buscamos definir el análisis PDPL de proteínas citosólicas, que se consideran objetivos más difíciles que sus contrapartes localizadas en la membrana debido a su naturaleza altamente dinámica.La proteína bromodomain and extraterminal (BET) BRD4 ha atraído nuestra atención por su papel clave en diversas enfermedades 35, 36 .El complejo formado por BRD4 es un coactivador transcripcional y una importante diana terapéutica.Al regular la expresión de los factores de transcripción c-myc y Wnt5a, se cree que BRD4 es un determinante clave de la leucemia mieloide aguda (LMA), el mieloma múltiple, el linfoma de Burkitt, el cáncer de colon y las enfermedades inflamatorias37,38.Además, algunos virus se dirigen a BRD4 para regular la transcripción viral y celular, como el virus del papiloma, el VIH y el SARS-CoV-236,39.
Para mapear la interacción BRD4 usando PDPL, combinamos miniSOG con una isoforma corta N- o C-terminal de BRD4.Los resultados proteómicos revelaron un alto grado de superposición entre las dos construcciones (Fig. 9a complementaria).El proteoma nuclear identificado con miniSOG-H2B cubre el 77,6% de las proteínas que interactúan con BRD4 (Fig. 9b complementaria).Luego, se usaron diferentes tiempos de iluminación (2, 5, 10, 20 min) para ajustar el radio del marcador (Fig. 4a y datos complementarios 3).Llegamos a la conclusión de que en fotoperíodos más cortos, PDPL marcará principalmente socios de unión directa, mientras que los períodos más largos incluirán proteínas identificadas durante períodos de fotoactivación más cortos, así como objetivos indirectos en complejos de etiquetado.De hecho, encontramos una fuerte superposición entre puntos de tiempo adyacentes (84,6 % para 2 y 5 min; 87,7 % para 5 y 10 min; 98,7 % para 10 y 20 min) (Fig. 4b y Fig. 9c complementaria).En todos los grupos experimentales, encontramos no solo el autoetiquetado de BRD4, sino también varios objetivos conocidos como MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A y HMGB1 anotados en la base de datos de cadenas.La fuerza iónica de estos objetivos es proporcional al tiempo de exposición (Fig. 4c y Fig. 9d complementaria).El análisis GO de las proteínas identificadas en el grupo de 2 minutos mostró que las proteínas identificadas estaban localizadas en el núcleo y participaban en la remodelación de la cromatina y la función de la ARN polimerasa.La función molecular de la proteína se enriqueció en la unión a cromatina o la coactivación transcripcional, de acuerdo con la función BRD4 (Fig. 4d).El análisis de interacción de proteínas habilitado por la base de datos de cadenas reveló un primer nivel de interacciones indirectas entre BRD4 y los complejos de interacción de la familia HDAC, como SIN3A, NCOR2, BCOR y SAP130 (Fig. 4e y Fig. 9e complementaria), consistentes con BRD4 y HDAC que se unen a histonas acetiladas. ..Además, los objetivos representativos identificados por LC-MS/MS, incluidos Sin3A, NSUN2, Fus y SFPQ, se confirmaron mediante transferencia Western (Fig. 4f).Recientemente, se ha informado que la isoforma corta de BRD4 forma núcleos con propiedades de separación de fases líquido-líquido (LLPS).Las proteínas de unión a ARN Fus y SFPQ median el LLPS de varios procesos celulares y se han identificado aquí como proteínas de unión a BRD4 no registradas.La interacción entre BRD4 y SFPQ se confirmó mediante experimentos de co-inmunoprecipitación (co-IP) (Figura 4g), lo que sugiere otro mecanismo para la separación de fases líquido-líquido mediada por BRD4 que merece una mayor investigación.En conjunto, estos resultados sugieren que PDPL es una plataforma ideal para identificar proteínas de unión desconocidas y que interactúan con BRD4 conocidas.
a Representación esquemática del marcado de proximidad BRD4 mediado por miniSOG, tiempos de exposición: 2, 5, 10 y 20 min.b Superposición de proteínas identificadas en diferentes tiempos de iluminación.El enriquecimiento de proteínas identificado en HEK293T-miniSOG-BRD4 fue estadísticamente significativo en comparación con HEK293T de tipo salvaje.c Intensidad de iones al cuantificar proteínas de unión a BRD4 conocidas representativas no marcadas durante el tiempo de exposición especificado.n = 3 muestras biológicamente independientes.Los datos se presentan como media ± desviación estándar.d Análisis ontológico de genes (GO) de proteínas identificadas en el grupo de 2 minutos.Se enumeran los primeros diez términos GO.Las burbujas están coloreadas según la categoría del término GO y el tamaño de la burbuja es proporcional a la cantidad de proteínas que se encuentran en cada término.e Análisis de cadenas de proteínas que interactúan con BRD4.Los círculos amarillos son pegamento directo y los círculos grises son la primera capa de pegamento indirecto.Las líneas rojas representan las interacciones determinadas experimentalmente y las líneas azules representan las interacciones previstas.f Los objetivos de unión a BRD4 representativos identificados en LC-MS/MS se verificaron mediante transferencia Western.g Los experimentos de coinmunoprecipitación confirman la interacción entre SFPQ y BRD4.Estos experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares.Los datos sin procesar se proporcionan en forma de archivos de datos sin procesar.
Además de identificar objetivos asociados a POI no registrados, planteamos la hipótesis de que PDPL será adecuado para identificar sustratos para enzimas, lo que requeriría la caracterización de proteínas de unión indirecta en grandes complejos para anotar sustratos no registrados.Parkin (codificada por PARK2) es una ligasa E3 y se sabe que las mutaciones en parkin causan la enfermedad de Parkinson juvenil autosómica recesiva (AR-JP)42.Además, la parkina se ha descrito como esencial para la mitofagia (autofagia mitocondrial) y la eliminación de especies reactivas de oxígeno.Sin embargo, aunque se han identificado varios sustratos de parkina, el papel de la parkina en esta enfermedad sigue sin estar claro.Para anotar sus sustratos no caracterizados, se probó PDPL agregando miniSOG al extremo N o C de parkin.Las células se trataron con el transportador de protones de cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona (CCCP) para activar la parkina a través de la vía PINK1-Parkin.En comparación con nuestros resultados de BRD4 PDPL, la fusión del extremo N de parkin reveló un conjunto más grande de proteínas diana, aunque cubría una porción más grande del extremo C (177 de 210) (Figura 5a,b y Datos complementarios 4).el resultado es consistente con los informes de que las etiquetas N-terminal pueden activar Parkin44 de manera aberrante.Sorprendentemente, solo había 18 proteínas superpuestas en nuestros datos con los resultados AP-MS publicados para Parkin43, probablemente debido a las diferencias entre las líneas celulares y los flujos de trabajo proteómicos.Además de cuatro proteínas conocidas (ARDM1, HSPA8, PSMD14 y PSMC3) identificadas por dos métodos (Fig. 5c)43.Para validar aún más los resultados de LC-MS/MS, se usaron el tratamiento con PDPL y la posterior transferencia de Western para comparar los resultados del ensayo de células madre HEK293T y la línea de parkina N-terminal estable.Los objetivos previamente desconocidos CDK2, DUT, CTBP1 y PSMC4 se analizaron con un aglutinante conocido, DNAJB1 (Fig. 5d).
Gráfica de volcán de proteínas que interactúan con parkin en células HEK293T con miniSOG expresada de forma estable fusionada con el extremo N o C de parkin (n = 3 experimentos biológicos independientes).Se utilizó la prueba t de Student de dos colas en gráficos de volcanes.HEK293T se utilizó como control negativo. Las proteínas significativamente modificadas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia de intensidad de iones). Las proteínas significativamente modificadas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia de intensidad de iones). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Las proteínas significativamente alteradas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia en la intensidad de los iones).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Las proteínas significativamente alteradas se resaltan en rojo (p < 0,05 y > 2 veces la diferencia en la fuerza iónica).Las proteínas relacionadas importantes para HEK293T-miniSOG pero no importantes para HEK293T se muestran en verde.b Diagrama de Venn que muestra proteínas superpuestas entre construcciones N-terminal y C-terminal.Las etiquetas N-terminales pueden activar aberrantemente la parkina y dar como resultado proteínas más reconocibles.c Diagrama de Venn que muestra proteínas superpuestas entre PDPL y AP-MS.Se enumeran los interactores conocidos, incluidos 4 de 18 proteínas superpuestas y 11 de 159 proteínas identificadas específicamente en PDPL.d Los objetivos representativos identificados por LC-MS/MS se verificaron mediante transferencia Western.e Ssu72 y SNW1 se identificaron como sustratos de parkin no registrados.Estos plásmidos de proteína marcados con FLAG se transfectaron en HEK293T y HEK293T-Parkin-miniSOG seguidos de tratamiento con CCCP en varios momentos.La degradación fue más pronunciada en la línea de sobreexpresión de Parkin.f Usando el inhibidor de proteasoma MG132, se confirmó que el proceso de degradación de Ssu72 y SNW1 está mediado por la ubiquitinación del proteasoma.Estos experimentos se repitieron de forma independiente al menos dos veces con resultados similares.Los datos sin procesar se proporcionan en forma de archivos de datos sin procesar.
En particular, las proteínas identificadas por PDPL deben incluir proteínas de unión a parkina y sus sustratos.Para detectar sustratos de parkina no registrados, seleccionamos siete proteínas identificadas (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 y SNW1) y plásmidos transfectados para exponer estos genes a HEK293T normal y expresar de manera estable HEK293T de miniSOG-Parkin seguido de tratamiento con CCCP.Los niveles de proteínas Ssu72 y SNW1 se redujeron significativamente en la línea miniSOG-Parkin estable (Fig. 5e).El tratamiento con CCCP durante 12 horas dio como resultado la degradación más significativa de ambos sustratos.Para investigar si la degradación de Ssu72 y SNW1 está regulada por la ubiquitinación del proteasoma, se agregó el inhibidor del proteasoma MG132 para inhibir la actividad del proteasoma y, de hecho, descubrimos que su proceso de degradación estaba inhibido (Fig. 5f).Los objetivos adicionales que no son sustratos se confirmaron como interactuadores de Parkin mediante transferencia Western (Fig. 10 complementaria), que mostró resultados consistentes con LC-MS/MS.En conclusión, la integración del flujo de trabajo de PDPL con la verificación de la transfección de la proteína objetivo permite la identificación de sustratos de ligasa E3 no registrados.
Hemos desarrollado una plataforma común de marcado de proximidad que le permite identificar en el espacio y el tiempo los puntos de interés que interactúan.La plataforma se basa en la proteína fotosensibilizadora miniSOG, que tiene solo unos 12 kDa, menos de la mitad del tamaño de la enzima APEX2 madura (27 kDa) y un tercio del tamaño de TurboID (35 kDa).El tamaño más pequeño debería expandir en gran medida la gama de aplicaciones para estudiar interactomas de proteínas pequeñas.Se necesita una mayor exploración de fotosensibilizadores adicionales, ya sean proteínas codificadas genéticamente o moléculas pequeñas, para aumentar el rendimiento cuántico de oxígeno singulete y expandir la sensibilidad de este enfoque.Para la versión actual de miniSOG, se puede lograr una alta resolución temporal utilizando iluminación azul para activar los marcadores de proximidad.Además, un tiempo de exposición más largo liberó una "nube" más grande de oxígeno singulete, lo que resultó en la modificación de residuos de histidina más distales, un mayor radio de etiquetado y la capacidad de ajustar la resolución espacial de PDPL.También probamos siete sondas químicas para aumentar la relación señal-fondo y exploramos el mecanismo molecular detrás de este enfoque.El flujo de trabajo TOP-ABPP combinado con una búsqueda abierta imparcial confirmó que las modificaciones ocurrieron solo en las histidinas y no se observó un microambiente consistente para el aumento de las modificaciones de histidina, excepto por una preferencia moderada por las histidinas en la región del bucle.
PDPL también se ha utilizado para caracterizar proteomas subcelulares con especificidad y cobertura de proteoma al menos comparable con otros métodos de sonda química específicos de orgánulos y etiquetado de proximidad.Los marcadores de proximidad también se han utilizado con éxito para caracterizar los proteomas de superficie, lisosomales y asociados al secretoma46,47.Creemos que PDPL será compatible con estos orgánulos subcelulares.Además, desafiamos a PDPL al identificar objetivos para la unión a proteínas citosólicas que son más complejos que las proteínas unidas a la membrana debido a sus propiedades dinámicas y su participación en interacciones más temporales.Se aplicó PDPL a dos proteínas, el coactivador transcripcional BRD4 y la ligasa E3 Parkin asociada a la enfermedad.Estas dos proteínas fueron elegidas no solo por sus funciones biológicas fundamentales, sino también por su relevancia clínica y potencial terapéutico.Para estos dos puntos de interés, se identificaron socios vinculantes conocidos, así como objetivos no registrados.En particular, la proteína SFPQ asociada a la separación de fases fue confirmada por co-IP, lo que puede indicar un nuevo mecanismo por el cual BRD4 (isoforma corta) regula LLPS.Al mismo tiempo, creemos que la identificación de sustratos de Parkin es un escenario en el que se requiere la identificación de adhesivos indirectos.Identificamos dos sustratos de parkina no identificados y confirmamos su degradación a lo largo de la vía de ubiquitinación-proteasoma.Recientemente, se ha desarrollado una estrategia de captura basada en mecanismos para detectar sustratos de hidrolasa atrapándolos con enzimas.Aunque este es un método muy poderoso, no es adecuado para el análisis de sustratos involucrados en la formación de grandes complejos y requiere la formación de enlaces covalentes entre la enzima y el sustrato.Esperamos que PDPL se pueda ampliar para estudiar otros complejos de proteínas y familias de enzimas, como las familias de deubiquitinasa y metaloproteasa.
Se ha desarrollado una nueva forma de miniSOG, denominada SOPP3, con una producción mejorada de oxígeno singulete.Comparamos miniSOG con SOPP3 y encontramos un mejor rendimiento de marcado, aunque la relación señal-ruido se mantuvo sin cambios (Fig. 11 complementaria).Presumimos que la optimización de SOPP3 (por ejemplo, a través de la evolución dirigida) conduciría a proteínas fotosensibilizadoras más eficientes que requieren tiempos de luz más cortos y, por lo tanto, permitirían capturar procesos celulares más dinámicos.En particular, la versión actual de PDPL se limita al entorno celular, ya que requiere iluminación con luz azul y no puede penetrar en los tejidos profundos.Esta característica impide su uso en estudios de modelos animales.Sin embargo, la combinación de optogenética con PDPL podría brindar una oportunidad para la investigación en animales, especialmente en el cerebro.Además, otros fotosensibilizadores infrarrojos diseñados también eliminan esta limitación.Actualmente se están realizando investigaciones en esta área.
La línea celular HEK293T se obtuvo de ATCC (CRL-3216).La línea celular resultó negativa para la infección por micoplasma y se cultivó en DMEM (Thermo, n.° C11995500BT) complementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Vistech, n.° SE100-B) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Hyclone, n.° SV30010).creció en.
Se adquirieron 3-aminofenileno (muestra 3) y (4-etinilfenil)metanamina (muestra 4) de Bidepharm.La propilamina (sonda 2) se adquirió de Energy-chemicals.Se sintetizó N-(2-aminofenil)pent-4-inamida (sonda 1) según métodos publicados.
La Tabla complementaria 1 enumera las construcciones genéticas utilizadas en este estudio.Las secuencias miniSOG y KillerRed se clonaron a partir de un plásmido regalo de P. Zou (Universidad de Pekín).La secuencia dirigida a la matriz mitocondrial se derivó de los 23 aminoácidos N-terminales de COX4 y se clonó en los vectores indicados usando un ensamblaje Gibson (Beyotime, #D7010S).Para apuntar a la membrana y el núcleo del retículo endoplásmico, ADN humano SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificado por PCR de una biblioteca de ADNc de células HEK293T y ADN H2B (donado por D. Lin, Laboratorio de la Bahía de Shenzhen) y clonado, como se mencionó anteriormente.A menos que se indique lo contrario, otros genes de proteínas utilizados para la transfección y la construcción de líneas celulares estables se amplificaron por PCR a partir de la biblioteca de ADNc de células HEK293T.Se usaron G3S (GGGS) y G4S (GGGGS) como conectores entre la proteína cebo y miniSOG.Se añadió una etiqueta de epítopo V5 (GKPIPNPLLGLDST) a estas construcciones de fusión.Para la expresión en mamíferos y para establecer una línea celular estable, la construcción de fusión miniSOG se subclonó en el vector lentiviral pLX304.Para la expresión bacteriana, se clonó miniSOG en el vector pET21a marcado con 6xHis en el extremo C-terminal.
Se sembraron células HEK293T a razón de 2,0 x 105 células por pocillo en placas de seis pocillos y se transfectaron 24 horas después con plásmidos lentivirales recombinantes (2,4 μg pLX304) y plásmidos de empaquetamiento viral (1,5 μg psPAX2 y 1,2 μg pMD2.G) usando Lipo8000 (Beyotime , #C0533), alrededor del 80 % de fusión.Después de la transfección durante la noche, se cambió el medio y se incubó durante otras 24 horas.La recolección del virus se realizó a las 24, 48 y 72 horas.Antes de la infección de las líneas celulares diana, el medio viral se filtró a través de un filtro de 0,8 μm (Merck, #millex-GP) y se añadió polibreno (Solarbio, #H8761) a una concentración de 8 μg/ml.Después de 24 horas, se permitió que las células se recuperaran cambiando el medio.Las células se seleccionaron usando 5 μg/ml de blasticidina (Solarbio, #3513-03-9) para los primeros tres pases como una selección más estricta.Luego usó 20 μg/ml como un régimen más estricto para los siguientes tres pases.
Las células se sembraron en cámaras de 12 pocillos (Ibidi, #81201) a una densidad de aproximadamente 20.000 células por pocillo.Para mejorar la adhesión de las células HEK293T, agregue 50 µg/ml de fibronectina (Corning, n.° 356008) diluida en solución salina tamponada con fosfato (PBS, Sangon, n.° B640435) a 37 °C.Las cámaras se pretrataron durante 1 hora y luego se retiraron con PBS.Después de 24 h, las células se lavaron una vez con PBS, se incubaron con sonda 3 1 mM en solución salina equilibrada de Hanks fresca (HBSS, Gibco, n.° 14025092) durante 1 h a 37 °C y luego se incubaron con un LED azul (460 nm ).) fueron irradiados durante 10 min a temperatura ambiente.Después de eso, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con formaldehído al 4% en PBS (Sangon, #E672002) durante 15 minutos a temperatura ambiente.Se eliminó el exceso de formaldehído de las células fijadas lavando tres veces con PBS.A continuación, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % (Sangon, nº A600198) en PBS y se lavaron 3 veces con PBS.Luego retire la cámara y agregue a cada muestra 25 µl de una mezcla de reacción de clic que contenga Cy3-azida 50 µM (Aladdin, n.° C196720), CuSO4 2 mM (Sangon, n.° A603008), BTTAA 1 mM (Confluore, n.° BDJ-4) y 0,5 mg/ml de ascorbato de sodio (Aladdin, n.º S105024) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de una reacción rápida, las células se lavaron seis veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % (Sangon, n.° A600560) (PBST) y luego se bloquearon con BSA al 5 % (Abcone, n.° B24726) en PBST durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Para la inmunotinción de colocalización, las células se incubaron con anticuerpos primarios de acuerdo con las condiciones indicadas: mAb anti-V5 de ratón (1:500, CST, #80076), mAb anti-Hsp60 de conejo (1:1000), ABclonal, #A0564), anticuerpo anti-calnexina policlonal de conejo (1:500, Abcam, #ab22595) o anticuerpo monoclonal anti-lamina A/C de conejo (1:500; CST, #2032) a 4 °C durante la noche.Después de lavar 3 veces con PBST, las células se incubaron con anticuerpos secundarios: cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluido 1:1000, cabra anti-ratón Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluido 1:1000.dilución Diluir a temperatura ambiente durante 30 minutos.Luego, las células se lavaron 3 veces con PBST y se contrastaron con DAPI (Thermo, #D1306) en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.Después de 3 lavados con PBS, las células se sellaron en glicerol al 50 % (Sangon, #A600232) en PBS para obtener imágenes.Las imágenes inmunofluorescentes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 y el software ZNE 3.5.
Para la formación de imágenes fluorescentes de oxígeno singlete, las células se lavaron dos veces con tampón Hanks HEPES antes de añadir Si-DMA 100 nM en tampón Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Después de la exposición a la luz, las células se incubaron en una incubadora de CO2 a 37°C durante 45 minutos.A continuación, las células se lavaron dos veces con tampón HEPES de Hanks y se contrastaron con Hoechst en tampón HEPES de Hanks durante 10 minutos a temperatura ambiente y se visualizaron con un microscopio confocal ZEISS LSM 900., #M36008) en tampón HBSS que contiene calcio y magnesio.Después de la exposición a la luz oa la doxorrubicina (MCE, #HY-15142A), las células se incubaron en una incubadora de CO2 a 37 °C durante 10 minutos, se lavaron dos veces con tampón HBSS y se incubaron con Hoechst en tampón HBSS a temperatura ambiente.minutos.Se usó doxorrubicina como control de sonda positivo donde las células se trataron con doxorrubicina 20 μM en HBSS que contenía BSA al 1% durante 30 min.Las imágenes inmunofluorescentes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 900.
Se sembraron células HEK293T que expresan de forma estable mito-miniSOG a una densidad de aproximadamente el 30 % en placas de 15 cm.Después de 48 horas, cuando se alcanzó una confluencia de ~80 %, las células se lavaron una vez con PBS, se incubaron con Sonda 3 1 mM en tampón HBSS fresco durante 1 hora a 37 °C y luego se iluminaron con un LED azul durante 10 minutos a temperatura ambiente. la temperatura..A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS, se rasparon y se resuspendieron en tampón PBS enfriado con hielo que contenía inhibidores de proteasa sin EDTA (MCE, #HY-K0011).Las células se lisaron sonicando la punta durante 1 minuto (1 segundo encendido y 1 segundo apagado al 35% de amplitud).La mezcla resultante se centrifugó a 15 871 xg durante 10 min a 4 °C para eliminar los desechos y la concentración del sobrenadante se ajustó a 4 mg/ml utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime, n.° P0009).Combine 1 ml del lisado anterior con azida de biotina fotodegradable 0,1 mM (Confluore, n.° BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, n.° A600974), ligando TBTA 0,1 mM (Aladdin, n.° T162437) e incubadora CuSO4 1 mM con fondo rotación hacia arriba durante 1 hora a temperatura ambiente.Después de una reacción instantánea, agregue la mezcla a la solución premezclada (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) en un vial de vidrio de 10 ml.Las muestras se mezclaron y centrifugaron a 4500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.Se descartaron las soluciones inferior y superior, el precipitado se lavó dos veces con 1 ml de metanol y se centrifugó a 15871xg durante 5 min a 4°C.Añadir 1 ml de urea 8 M (Aladdin, n.º U111902) en bicarbonato de amonio 25 mM (ABC, Aladdin, n.º A110539) para disolver el precipitado.Las muestras se reconstituyeron con ditiotreitol 10 mM (Sangon, n.° A100281 en ABC 25 mM) durante 40 minutos a 55 °C, seguido de la adición de yodoacetamida fresca 15 mM (Sangon, n.° A600539) a temperatura ambiente en la oscuridad.Alquilación en 30 minutos..Se añadió ditiotreitol 5 mM adicional para detener la reacción.Prepare aproximadamente 100 µl de perlas de agarosa NeutrAvidin (Thermo, n.º 29202) para cada muestra lavando 3 veces con 1 ml de PBS.La solución de proteoma anterior se diluyó con 5 ml de PBS y se incubó con perlas de agarosa NeutrAvidin prelavadas durante 4 horas a temperatura ambiente.A continuación, las perlas se lavaron 3 veces con 5 ml de PBS que contenía SDS al 0,2 % (Sangon, n.º A600485), 3 veces con 5 ml de PBS que contenía urea 1 M y 3 veces con 5 ml de ddH2O.Luego, las perlas se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en 200 μl de ABC 25 mM que contenía urea 1 M, CaCl 2 1 mM (Macklin, #C805228) y 20 ng/μl de tripsina (Promega, #V5280).Trypsinize durante la noche a 37°C con rotación.La reacción se detuvo añadiendo ácido fórmico (Thermo, # A117-50) hasta que el pH alcanzó 2-3.Las perlas se lavaron 3 veces con 1 ml de PBS que contenía SDS al 0,2 %, 3 veces con 1 ml de PBS que contenía urea 1 M y luego 3 veces con 1 ml de agua destilada.Los péptidos modificados se liberaron mediante lisis ligera (365 nm) durante 90 min utilizando 200 μl de MeOH al 70 %.Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante.A continuación, las perlas se lavaron una vez con 100 μl de MeOH al 70 % y se agruparon los sobrenadantes.Las muestras se secaron en un concentrador de vacío Speedvac y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis.
Para identificar y cuantificar los péptidos modificados con oxígeno singulete, las muestras se volvieron a disolver en ácido fórmico al 0,1 % y se analizó 1 μg de péptidos utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado con una fuente nano ESI de Tune y Xcalibur del software del proveedor 4.3.Las muestras se separaron en una columna capilar empaquetada internamente de 75 µm × 15 cm con material C18 de 3 µm (ReproSil-pur, n.° r13.b9.) y se conectaron a un sistema UHPLC EASY-nLC 1200 (Thermo).Los péptidos se separaron mediante cromatografía de gradiente lineal de 95 minutos desde el 8 % de disolvente B hasta el 50 % de disolvente B (A = 0,1 % de ácido fórmico en agua, B = 0,1 % de ácido fórmico en 80 % de acetonitrilo), luego se aumentó linealmente hasta el 98 % de B min. en 6 min a un caudal de 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos recopila datos alternativamente entre el escaneo completo de MS y el escaneo de MS2, según los datos.El voltaje de bombardeo iónico se ajustó a 2,1 kV y la temperatura del capilar de transporte de iones fue de 320°C.Los espectros de MS (350-2000 m/z) se recopilaron con una resolución de 120 000, AGC 4 × 105 y un tiempo de entrada máximo de 150 ms.Los 10 precursores con carga múltiple más comunes en cada escaneo completo se fragmentaron utilizando HCD con una energía de colisión normalizada del 30 %, una ventana de aislamiento de cuadrupolo de 1,6 m/z y una configuración de resolución de 30 000.Un objetivo AGC para espectrometría de masas en tándem que utiliza 5×104 y un tiempo de entrada máximo de 150 ms.La excepción dinámica se establece en 30 segundos. Los iones no asignados o aquellos con una carga de 1+ y >7+ fueron rechazados por MS/MS. Los iones no asignados o aquellos con una carga de 1+ y >7+ fueron rechazados por MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Los iones no asignados o los iones con una carga de 1+ y >7+ fueron rechazados por MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Los iones no especificados o los iones con cargas de 1+ y >7+ se rechazaron para MS/MS.
Los datos sin procesar se procesan utilizando la plataforma informática FragPipe basada en MSFragger.Los sesgos de masa y los aminoácidos correspondientes se determinaron utilizando un algoritmo de búsqueda abierto con una tolerancia de masa precursora de -150 a 500 Da.A continuación, se identificaron los péptidos modificados utilizando modificaciones de histidina con ganancias de masa de +229,0964 y +247,1069 Da en PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Las células que expresaban de forma estable el gen miniSOG fusionado se sembraron en placas de 6 cm.Al alcanzar una confluencia de ~80 %, las células se lavaron una vez con HBSS (Gibco, n.° 14025092), luego se incubaron con sondas químicas en HBSS durante 1 hora a 37 °C y se iluminaron con luz azul.LED de 10W durante 20 minutos a temperatura ambiente.Para determinar qué tipo de especie de oxígeno reactivo está involucrada en PDPL, vitamina C 0,5 mM (MCE, n.° HY-B0166), Trolox 5 mM (MCE, n.° HY-101445), D2O (Sigma, n.° 7789-20-0), Se añadieron a las células manitol 100 mM (Energy Chemical, #69-65-8), H2O2 100 μM, NaN3 10 mM como suplementos.Después de lavar con PBS frío, las células se rasparon, se recogieron en tubos de centrífuga de 1,5 ml y se sonicaron con una punta durante 1 min en 200 μl de PBS con inhibidor de proteasa 1x sin EDTA (1 s y 1 s sin, amplitud 35 %).La mezcla resultante se centrifugó a 15 871 × g durante 10 min a 4 °C y la concentración del sobrenadante se ajustó a 1 mg/ml utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA.Aproximadamente 50 µl del lisado anterior se incubaron con rodamina azida 0,1 mM (Aladdin, n.° T131368), TCEP 1 mM, ligando TBTA 0,1 mM y CuSO4 1 mM durante 1 hora a temperatura ambiente con rotación de abajo hacia arriba.Después de la reacción de clic, se llevó a cabo la precipitación con acetona agregando 250 μl de acetona preenfriada a las muestras, incubando a -20 °C durante 20 min y centrifugando a 6010 × g durante 10 min a 4 °C.Recoger el precipitado y hervir en 50 l de tampón de Laemmli 1x durante 10 min a 95 ° C.Luego, las muestras se analizaron en geles largos SDS-PAGE y se visualizaron utilizando el sistema de imágenes Bio-rad ChemiDoc MP Touch con el software Image Lab Touch.
La expresión y purificación de la proteína miniSOG-6xHis recombinante se realizó como se describió anteriormente.Brevemente, se transformaron células de E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) con pET21a-miniSOG-6xHis y se indujo la expresión de la proteína con IPTG 0,5 mM (Sangon, #A600168).Después de la lisis celular, las proteínas se purificaron utilizando perlas de agarosa Ni-NTA (MCE, n.° 70666), se dializaron frente a PBS y se almacenaron a –80 °C.
Para un ensayo de proximidad de etiquetas in vitro basado en anticuerpos, mezcle miniSOG purificado 100 μM, sonda 3 1 mM y 1 μg de anticuerpo monoclonal de ratón anti-etiqueta (TransGen, #HT501-01) en PBS hasta un volumen de reacción total de 50 μl..La mezcla de reacción se irradió con luz LED azul durante 0, 2, 5, 10 y 20 min a temperatura ambiente.La mezcla se incubó con biotina-PEG3-azida 0,1 mM (Aladdin, #B122225), TCEP 1 mM, ligando TBTA 0,1 mM y CuSO4 1 mM durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador de movimiento ascendente.Después de una reacción instantánea, agregue 4x tampón de Laemmli directamente a la mezcla y hierva a 95°C durante 10 min.Las muestras se analizaron en geles SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia Western con estreptavidina-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Se utilizó un péptido sintético que contiene histidina con amidación C-terminal (LHDALDAK-CONH2) para analizar el etiquetado in vitro basado en péptidos cercanos.En este ensayo, se mezclaron miniSOG purificada 100 μM, sonda 3 10 mM y péptido sintético 2 μg/ml en PBS en un volumen de reacción total de 50 μl.La mezcla de reacción se irradió con luz LED azul durante 1 hora a temperatura ambiente.Se analizó un microlitro de muestra usando un sistema LC-MS (Waters, espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de movilidad de iones SYNAPT XS con software de análisis de espectro MassLynx).
Se sembraron células HEK293T que expresaban de forma estable el gen de fusión miniSOG en placas de 10 cm para líneas con diferente localización de orgánulos (Mito, ER, Nucleus) y placas de 15 cm para líneas Parkin-miniSOG y BRD4-miniSOG.Al alcanzar una confluencia de ~90 %, las células se lavaron una vez con HBSS, luego se incubaron con la sonda 3 en HBSS durante 1 hora a 37 °C y se iluminaron con un LED azul de 10 W a temperatura ambiente.Para el marcaje sin contacto de Parkin, se añadió portador de cianuro de carbonilo de protón 10 µM m-clorofenilhidrazona CCCP (Solarbio, #C6700) con sonda 3 en HBSS durante 1 hora a 37°C.Los pasos de lisis celular, química clic, reducción y alquilación fueron los mismos que los descritos anteriormente, excepto que se agregaron 2 mg de lisado y se usó biotina PEG3 azida en la reacción clic en lugar de biotina azida fotodegradable.Después del enriquecimiento, las perlas se lavaron 3 veces con 5 ml de PBS que contenía SDS al 0,2 %, 3 veces con 5 ml de PBS que contenía urea 1 M y 3 veces con 5 ml de PBS.A continuación, se añadieron 2 µg de tripsina a 300 µl de ABC 25 mM que contenía urea 1 M para escindir la proteína durante la noche a 37°C.La reacción se detuvo añadiendo ácido fórmico hasta que se alcanzó un pH de 2-3.Después de la tripsinización en perlas, la solución peptídica se desaló usando una columna SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) y se secó en un concentrador de vacío Speedvac.Los péptidos se volvieron a disolver en ácido fórmico al 0,1 % y se analizaron 500 ng de péptidos usando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid equipado con la fuente nano-ESI descrita anteriormente.Los péptidos se separaron en precolumnas comerciales de RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, n.° 164946) y columnas analíticas de RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, n.° 164941), ambas rellenas con 2 μm.gradiente de 8% a 35% ACN en 60 minutos, luego aumentó linealmente a 98% B en 6 minutos a una velocidad de flujo de 300 Nl/min.Los espectros de MS (350-1500 m/z) se recopilaron con una resolución de 60 000, AGC 4 × 105 y un tiempo de entrada máximo de 50 ms.Los iones seleccionados se fragmentaron secuencialmente mediante HCD en ciclos de 3 s con una energía de colisión normalizada del 30 %, una ventana de aislamiento de cuadrupolo de 1,6 m/z y una resolución de 15000. Un objetivo AGC de espectrómetro de masas en tándem de 5 × 104 y un tiempo de inyección máximo de 22 ms fueron utilizados.La exclusión dinámica se establece en 45 segundos. Los iones no asignados o aquellos con una carga de 1+ y >7+ fueron rechazados por MS/MS. Los iones no asignados o aquellos con una carga de 1+ y >7+ fueron rechazados por MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Los iones no asignados o los iones con una carga de 1+ y >7+ fueron rechazados por MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Los iones no especificados o los iones con cargas de 1+ y >7+ se rechazaron para MS/MS.
Los pasos de preparación de la muestra hasta el enriquecimiento de las perlas de NeutrAvidin fueron los mismos que en el análisis LC-MS/MS descrito anteriormente.Se usaron aproximadamente 50 μg de lisado como entrada para el control de carga y se usaron 2 mg de lisado para las reacciones de clic.Después del enriquecimiento y lavado con neutravidina, las proteínas unidas se eluyeron añadiendo 50 µl de tampón de Laemmli a las perlas de resina de agarosa y hirviéndolas a 95 ºC durante 5 minutos.Las muestras de entrada de carga de control y enriquecidas con perlas se analizaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, n.º ISEQ00010) mediante métodos de transferencia Western estándar.Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5 % (Sangon, nº A600669) en TBS que contenía Tween-20 al 0,1 % (TBST) y se incubaron secuencialmente con anticuerpos primarios y secundarios.Los anticuerpos primarios se diluyeron 1:1000 en leche descremada al 5 % en TBST y se incubaron durante la noche a 4 °C.Los anticuerpos secundarios se utilizaron en una proporción de 1:5000 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.Las membranas se visualizaron por quimioluminiscencia usando el sistema de imágenes Chemidoc MP.Todos los escaneos sin cortes de transferencias y geles en la figura se presentan como datos sin procesar.
Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio incluyeron anticuerpo monoclonal anti-SFPQ de conejo (CST, n.° 71992), anticuerpo monoclonal anti-FUS de conejo (CST, n.° 67840), anticuerpo policlonal anti-NSUN2 de conejo (Proteintech, n.° 20854-1- AP), anticuerpo policlonal anti-mSin3A de conejo (Abcam, #ab3479), anticuerpo monoclonal anti-tag de ratón (TransGen, #HT201-02), anticuerpo monoclonal anti-β-actina de ratón (TransGen, #HC201-01), anticuerpo anti-tag de conejo -Anticuerpo monoclonal de CDK2 (ABclonal, #A0094), anticuerpo monoclonal de conejo contra CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticuerpo policlonal de conejo contra DUT (ABclonal, #A2901), anticuerpo policlonal de conejo contra PSMC4 (ABclonal, #A2505), anticuerpo anti- Anticuerpo policlonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Estos anticuerpos se usaron a una dilución 1:1000 en leche descremada al 5% en TBST.Los anticuerpos secundarios utilizados en este estudio incluyeron IgG anti-conejo (TransGen, #HS101-01), IgG anti-ratón (TransGen, #HS201-01) a una dilución de 1:5000.
Para investigar más a fondo si BRD4 interactúa con SFPQ, se sembraron en placas de 10 cm células estables HEK293T y BRD4-miniSOG que sobreexpresan HEK293T.Las células se lavaron con PBS frío y se lisaron en 1 ml de tampón de lisis Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) con inhibidor de proteasa sin EDTA durante 30 minutos a 4ºC.Después de eso, los lisados ​​se recogieron en tubos de centrífuga de 1,5 ml y se centrifugaron a 15.871 xg durante 10 min a 4 °C.El sobrenadante se recogió y se incubó con 5 µg de anticuerpo monoclonal de ratón marcado anti-V5 (CST, #80076) durante la noche a 4°C.Lave aproximadamente 50 µl de perlas magnéticas de proteína A/G (MCE, n.° HY-K0202) dos veces con PBS que contenga Tween-20 al 0,5 %.Luego, los lisados ​​celulares se incubaron con perlas magnéticas durante 4 horas a 4 ° C con rotación de abajo hacia arriba.Luego, las perlas se lavaron cuatro veces con 1 ml de tampón PBST y se hirvieron a 95 °C durante 5 min.Las muestras se analizaron en geles SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF utilizando métodos estándar de transferencia Western.Las membranas se bloquearon en leche descremada al 5% en TBST y se incubaron secuencialmente con anticuerpos primarios y secundarios.Anticuerpo primario Se usó anticuerpo monoclonal anti-SFPQ de conejo (CST, #71992) en una proporción de 1:1000 en leche descremada al 5 % en TBST y se incubó durante la noche a 4 °C.Se utilizó IgG anti-conejo en una proporción de 1:5000 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.Las membranas se visualizaron por quimioluminiscencia usando el sistema de imágenes Chemidoc MP.
Todas las estructuras utilizadas para el análisis del área de superficie accesible por solvente (SASA) se obtuvieron del banco de datos de proteínas (PDB)52 o de la base de datos de estructuras de proteínas AlphaFold53.Se calculó el SASA absoluto para cada residuo utilizando el programa FreeSASA.Solo se usaron datos SASA completos e inequívocos para la histidina marcada y sus vecinos para obtener el SASA medio para cada estructura.La accesibilidad relativa al solvente (RSA) para cada histidina se calculó dividiendo el valor absoluto de SASA por el área de superficie residual máxima empírica posible disponible para el solvente.A continuación, todas las histidinas se clasificaron como ocultas si el RSA medio estaba por debajo del 20 %; de lo contrario, expuestas56.
Los archivos sin procesar obtenidos en modo DDA se buscaron utilizando Proteome Discoverer (v2.5) o MSfragger (Fragpipe v15.0) en la base de datos de proteínas verificada SwissProt apropiada que contiene contaminantes comunes.Los péptidos requerían tripsina completa con dos sitios de escisión faltantes, metilación de carbamoilo como modificación fija y oxidación de metionina como modificación dinámica.Las tolerancias de peso del precursor y del fragmento se establecieron en 10 ppm y 0,02 Da (MS2 Orbitrap), respectivamente. Se eliminaron los impactos de contaminantes y se filtraron las proteínas para obtener una tasa de descubrimiento falso de <1 %. Se eliminaron los impactos de contaminantes y se filtraron las proteínas para obtener una tasa de descubrimiento falso de <1 %. Попаданиiencia ззрнESющих вещест neg Se eliminaron los impactos de contaminantes y se filtraron las proteínas para dar una tasa de detección falsa de <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попаданиiencia зззнESющих веществ ыли удалены, а белки оильтррованы д достижения ур л лжж ожжrero. <1%. Se eliminaron los impactos de contaminantes y se filtraron las proteínas para lograr una tasa de falsos positivos de <1 %.Para el análisis cuantitativo sin el uso de etiquetas, se utilizó el contenido de proteína normalizado de tres repeticiones biológicas.El análisis de localización subcelular de proteínas se realizó mediante el análisis Gene Ontology (GO) de DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 y bases de datos compiladas y publicadas por el grupo Alice Ting.El mapa del volcán se obtuvo de Perseus (v1.6.15.0). Los cambios en la abundancia de proteínas se probaron para determinar la significación estadística utilizando una prueba t de dos caras, y los aciertos de proteínas se identificaron con un cambio de abundancia> 2 (a menos que se indique lo contrario) y un valor de p <0.05. Los cambios en la abundancia de proteínas se probaron para determinar la significación estadística utilizando una prueba t de dos caras, y los aciertos de proteínas se identificaron con un cambio de abundancia> 2 (a menos que se indique lo contrario) y un valor de p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Los cambios en el contenido de proteínas se probaron para determinar la significación estadística utilizando una prueba t de dos colas, y las coincidencias de proteínas se identificaron con un cambio de contenido> 2 (a menos que se indique lo contrario) y un valor de p <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 命 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 P 值 <0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. La significación estadística de los cambios en el contenido de proteínas se probó mediante una prueba t de dos colas, y se determinaron coincidencias de proteínas para cambios de contenido> 2 (a menos que se indique lo contrario) y valores de p <0.05.El análisis de interacción de proteínas se realizó utilizando el análisis GO junto con la base de datos String.
Se realizaron tres réplicas biológicas con resultados similares.El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism (software GraphPad) y los gráficos de volcanes se generaron con Perseus (v1.6.15.0).Para comparar los dos grupos, los valores de p se determinaron utilizando una prueba t de Student de dos colas.Solo las proteínas singleton identificadas al menos dos veces en el grupo experimental se incluyeron en los gráficos de volcanes, y los valores faltantes correspondientes en el grupo de control se reemplazaron con Perseus de una distribución normal para que se pudiera calcular el valor p.Las barras de error representan la media ± desviación estándar.En los análisis proteómicos para el análisis estadístico, se retuvo la abundancia de proteínas que aparecían en al menos dos réplicas biológicas.No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra.Los experimentos no son aleatorios.Los investigadores no estaban ciegos a las tareas durante el experimento y la evaluación de los resultados.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del Informe de investigación de Nature vinculado a este artículo.
Los datos de espectrometría de masas obtenidos en este estudio se enviaron al Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios iProX57 con el ID de conjunto de datos PXD034811 (conjunto de datos PDPL-MS).Los datos sin procesar se proporcionan en forma de archivos de datos sin procesar.Este artículo proporciona los datos originales.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Conociendo el vecindario: uso de biotinilación dependiente de la proximidad para caracterizar complejos de proteínas y mapear orgánulos. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Conociendo el vecindario: uso de biotinilación dependiente de la proximidad para caracterizar complejos de proteínas y mapear orgánulos.Gingras, AS, Abe, KT y Raut, B. Familiaridad con el entorno: uso de biotinilación dependiente de la proximidad para caracterizar complejos de proteínas y mapear orgánulos. Gingras, AC, Abe, KT y Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Comprender el vecindario: utilizar la dependencia del vecindario de la vida biológica.Gingras, AS, Abe, KT y Raut, B. Comprensión de la proximidad: caracterización de complejos de proteínas y mapeo de orgánulos mediante biotinilación dependiente de la proximidad.Actual.Mi opinión.Químico.biología 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Mapeo del microambiente mediante la transferencia de energía Dexter a las células inmunitarias.Ciencia 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Las redes de escala de dos proteomas detectan la remodelación específica de células del interactoma humano.Celdas 184, 3022–3040.e3028 (2021).