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Las estrategias de diagnóstico tradicionales para detectar enfermedades infecciosas requieren el uso de instrumentos de sobremesa que no son adecuados para las pruebas en el punto de atención (POCT).La microfluídica emergente es una tecnología altamente miniaturizada, automatizada e integrada que es una alternativa potencial a los métodos tradicionales para diagnósticos in situ rápidos, de bajo costo y precisos.Los métodos de diagnóstico molecular se utilizan ampliamente en dispositivos de microfluidos como los métodos más efectivos para la detección de patógenos.Esta revisión resume los avances recientes en el diagnóstico molecular basado en microfluidos de enfermedades infecciosas desde una perspectiva académica e industrial.En primer lugar, describimos un procesamiento típico en chip de ácidos nucleicos, incluido el pretratamiento de muestras, la amplificación y la lectura de señales.Luego se comparan las características, ventajas y desventajas de los cuatro tipos de plataformas microfluídicas.A continuación, discutiremos el uso de ensayos digitales para la cuantificación absoluta de ácidos nucleicos.Los dispositivos de diagnóstico molecular basados ​​en microfluidos comerciales clásicos y recientes se resumen como evidencia del estado actual del mercado.Finalmente, proponemos direcciones futuras para el diagnóstico microfluídico de enfermedades infecciosas.
Las enfermedades infecciosas son causadas por patógenos, que incluyen bacterias, virus y parásitos, que se distribuyen por todo el mundo.A diferencia de otras enfermedades, los patógenos se infectan rápidamente y se propagan entre humanos y animales huéspedes a través de la inoculación, el aire y el agua [1].La prevención de enfermedades infecciosas es fundamental como medida de salud pública.Tres estrategias principales para combatir las enfermedades infecciosas: (1) controlar la fuente de infección;(2) interrupción de la ruta de transmisión;(3) protección de poblaciones susceptibles.Entre las principales estrategias, el control de la fuente de infección se considera la estrategia más importante debido a su conveniencia y bajo costo.El diagnóstico rápido, el aislamiento y el tratamiento de las personas infectadas son fundamentales y requieren estrategias de diagnóstico rápidas, sensibles y precisas [2].El diagnóstico actual de enfermedades infecciosas generalmente combina el examen clínico basado en signos y síntomas y estudios de laboratorio como cultivo celular y diagnóstico molecular, que requieren personal capacitado, procedimientos laboriosos y equipos de prueba costosos [3, 4].La prevención de brotes de enfermedades infecciosas requiere un diagnóstico local rápido, económico y preciso, especialmente en áreas de recursos limitados donde las enfermedades infecciosas son comunes y graves [5], así como el tratamiento en la naturaleza o en el campo de batalla, donde las emergencias son impredecibles..la atención médica es limitada [6].En este contexto, la microfluídica es una tecnología que combina tecnologías de sistemas microelectromecánicos, nanotecnología o ciencia de materiales para la manipulación precisa de fluidos [7,8,9,10], lo que brinda nuevas posibilidades para la detección en el punto de atención (POCT).) agentes infecciosos fuera de hospitales y laboratorios.En comparación con los diagnósticos tradicionales que consumen mucho tiempo, la tecnología de microfluidos ofrece ahorros de muestras y costos para los diagnósticos moleculares durante los brotes de enfermedades.La propagación mundial de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), por lo que se vuelve a enfatizar la importancia de la microfluídica para la prevención y el control oportunos de la pandemia [11, 12 , 13].A diferencia de los diagnósticos tradicionales, la POCT microfluídica utiliza pequeños dispositivos portátiles que van desde analizadores de sobremesa hasta pequeñas tiras reactivas laterales para realizar pruebas cerca del punto de muestreo [14].Estas pruebas cuentan con una preparación de muestra simple o nula, amplificación de señal rápida y lecturas de señal sensibles que dan como resultado una duración corta y resultados precisos en cuestión de minutos.La disponibilidad y la producción en masa de instrumentos sanitarios basados ​​en microfluidos han ampliado sus aplicaciones de diagnóstico directas y rentables fuera del hospital, cerca del paciente e incluso en el hogar.
Entre las estrategias existentes para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, el diagnóstico molecular es una de las más sensibles [15, 16].Además, el diagnóstico molecular a menudo se usa como el estándar de oro para la detección continua de COVID-19, lo que permite la detección directa de regiones de ARN o ADN específicas del virus antes del inicio de una respuesta inmune [17, 18].En la revisión actual, presentamos los últimos avances en procesos de diagnóstico molecular basados ​​en microfluidos para enfermedades infecciosas, desde una perspectiva académica hasta futuras perspectivas industriales (Fig. 1).Comenzaremos con tres pasos clave en la detección de ácidos nucleicos: pretratamiento de muestras en el chip, amplificación de ácidos nucleicos y lectura de señales.Luego comparamos diferentes tipos de plataformas microfluídicas con su estructura y función, mostrando características únicas (fortalezas y debilidades).La detección digital de ácidos nucleicos se analiza más a fondo y se da como ejemplo de una tecnología de tercera generación para la cuantificación absoluta de moléculas de patógenos infecciosos.Además, se presentarán varios dispositivos POCT comerciales típicos y más recientes para demostrar el estado actual del mercado POCT microfluídico para diagnóstico molecular.También discutiremos y explicaremos nuestra visión para aplicaciones futuras.
Los módulos de chips microfluídicos para la detección de ácidos nucleicos se pueden dividir en tres categorías (muestreo, reconocimiento y señalización) según sus funciones [19].Entre estos módulos, el módulo de muestreo realiza principalmente la lisis de muestras y la extracción de ácidos nucleicos.El módulo sensor controla principalmente la conversión y amplificación de señales de ácido nucleico.El módulo de señalización detecta la señal convertida y procesada por el módulo de detección.Basándonos en el proceso de detección de ácidos nucleicos en un chip, resumiremos los diversos chips que pueden realizar la función de "entrada y salida".
El primer paso en la detección de ácidos nucleicos es la extracción de ácidos nucleicos, es decir, aislar el ácido nucleico diana de la muestra original.La extracción de ácidos nucleicos se realiza para purificar los ácidos nucleicos de otros contaminantes moleculares, garantizar la integridad de la estructura primaria de las moléculas de ácidos nucleicos y optimizar los resultados.La extracción de ácidos nucleicos requiere la lisis de muestras y la captura de ácidos nucleicos necesarias, cuya calidad y eficiencia tienen un gran impacto en los resultados de investigación y diagnóstico.Cualquier efecto secundario sutil durante la extracción puede limitar una mayor detección.Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los métodos de amplificación isotérmica en bucle (LAMP) son inhibidos por algunos solventes orgánicos residuales como el etanol y el isopropanol en los reactivos de aislamiento de ácidos nucleicos [20].La extracción líquido-líquido y la extracción en fase sólida son los métodos más populares para aislar ácidos nucleicos [21]. Sin embargo, la extracción líquido-líquido en un chip es extremadamente limitada, ya que los reactivos utilizados en la extracción líquido-líquido provocan la corrosión de la mayoría de los chips microfluídicos. .Aquí, destacamos los métodos de extracción en fase sólida basados ​​en micromatrices y comparamos sus ventajas y desventajas.
El silicio es un material de sustrato compatible con los ácidos nucleicos debido a su biocompatibilidad, estabilidad y facilidad de modificación [22].Es importante destacar que, cuando se modifica con sílice u otros materiales, este compuesto exhibe propiedades para adsorber ácidos nucleicos cargados negativamente en condiciones de bajo pH y alto contenido de sal mientras eluye con soluciones de alto pH y bajo contenido de sal.Basándose en este fenómeno, es posible purificar el ácido nucleico.
Se han utilizado diversas formas de materiales a base de sílice para la extracción de ácidos nucleicos en microfluidos, como perlas de sílice, polvos, filtros de microfibras y membranas de sílice [23, 24, 25, 26].Dependiendo de las propiedades del material, los materiales a base de silicio se pueden usar en microcircuitos de diferentes maneras.Por ejemplo, los gránulos de sílice, los polvos y los nanofiltros comerciales pueden colocarse simplemente en los poros o microcanales de los chips de microfluidos y ayudar a extraer los ácidos nucleicos de las muestras [27, 28, 29].Las membranas de sílice modificadas en la superficie también se pueden usar para purificar rápidamente el ADN de los patógenos a bajo costo.Por ejemplo, Wang et al.[30] Al combinar reacciones de amplificación desnaturalizante con intercambio de cadena mediado por vesículas con membranas de sílice recubiertas con oligosacáridos de quitosano, se introdujo un sistema portátil versátil que detectó con éxito 102–108 unidades formadoras de colonias.(UFC)/ml Vibrio parahaemolyticus., y la presencia del virus era fácilmente visible.Powell et al.[31] A continuación, se utilizaron micromatrices a base de silicio para detectar el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del Zika y el virus del papiloma humano y la propagación automática, en la que se desarrolló un microrreactor tortuoso de 1,3 μl para capturar los virus de ARN.y realizar amplificación in situ.Además de estos métodos, las microcolumnas de sílice modificadas en la superficie también desempeñan un papel clave en la extracción de ácidos nucleicos, ya que la geometría y las propiedades del material modificador aumentan en gran medida la eficiencia de la extracción.Chen et al.[32] propusieron una plataforma microfluídica para el aislamiento de ARN de baja concentración basada en microcolumnas de silicio recubiertas de amino.Este dispositivo de microfluidos integra una matriz de micropilares de 0,25 cm2 en un sustrato de silicio para lograr una mayor eficiencia de extracción a través de un diseño de alta relación área superficial/volumen.La ventaja de este diseño es que el dispositivo de microfluidos puede lograr una eficiencia de extracción de ácido nucleico de hasta el 95 %.Estas estrategias basadas en silicio demuestran el valor de aislar rápidamente ácidos nucleicos a bajo costo.En combinación con chips de microfluidos, las estrategias de extracción basadas en silicio no solo pueden aumentar la eficiencia de la detección de ácidos nucleicos, sino que también facilitan la miniaturización y la integración de dispositivos analíticos [20].
Los métodos de separación magnética utilizan partículas magnéticas para aislar ácidos nucleicos en presencia de un campo magnético externo.Las partículas magnéticas comúnmente utilizadas incluyen partículas magnéticas Fe3O4 o γ-Fe2O3 recubiertas con sílice, amino y carboxilo [33,34,35,36].La característica distintiva de las partículas magnéticas en comparación con los métodos SPE basados ​​en silicio es la facilidad de manipulación y control con imanes externos.
Utilizando la interacción electrostática entre los ácidos nucleicos y la sílice, en condiciones de sal alta y pH bajo, los ácidos nucleicos se adsorben en la superficie de las partículas magnéticas recubiertas de sílice, mientras que en condiciones de sal baja y pH alto, las moléculas se pueden lavar. otra vez..Las perlas magnéticas recubiertas de sílice permiten extraer ADN de muestras de gran volumen (400 μL) utilizando un movimiento controlado magnéticamente [37].Como demostración, Rodríguez-Mateos et al.[38] utilizaron imanes sintonizables para controlar la transferencia de perlas magnéticas a diferentes cámaras.Basado en partículas magnéticas recubiertas de sílice, se pueden extraer 470 copias/mL de ARN genómico de SARS-CoV-2 de muestras de aguas residuales para la detección de transcripción inversa LAMP (RT-LAMP) y la respuesta se puede leer en 1 hora.ojo desnudo (Fig. 2a).
Dispositivos basados ​​en materiales magnéticos y porosos.Diagrama conceptual del dispositivo microfluídico IFAST RT-LAMP para la detección de ARN del SARS-CoV-2 (adaptado de [38]).b Microdispositivo centrífugo para dSPE de ácido nucleico de hisopo bucal (adaptado de [39]).c Concentrador de muestras autoalimentado incorporado que utiliza una tarjeta FTA® (adaptado de [50]).d Papel de filtro Fusion 5 modificado con quitosano (adaptado de [51]).SARS-CoV-2 síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2, amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa RT-LAMP, socios tecnológicos de buscadores FTA, ácido nucleico NA
Las partículas magnéticas cargadas positivamente son ideales para unir el esqueleto de fosfato de un ácido nucleico.A una determinada concentración de sal, los grupos fosfato de ácidos nucleicos cargados negativamente pueden cargarse positivamente en la superficie de las partículas compuestas magnéticas.Por lo tanto, se desarrollaron nanopartículas magnéticas con una superficie rugosa y una alta densidad de grupos amino para la extracción de ácidos nucleicos.Después de la separación y el bloqueo magnéticos, las nanopartículas magnéticas y los complejos de ADN se pueden usar directamente en la PCR, lo que elimina la necesidad de operaciones de purificación y elución complejas y que consumen mucho tiempo [35].También se han utilizado nanopartículas magnéticas recubiertas con grupos carboxilo negativos para separar ácidos nucleicos adsorbidos en superficies en soluciones de cloruro de sodio y polietilenglicol de alta concentración [36].Con estas perlas magnéticas de superficie modificada, la extracción de ADN es compatible con la posterior amplificación.Dignan et al.[39] describieron una plataforma microfluídica centrífuga automatizada y portátil para el pretratamiento de ácidos nucleicos, lo que permite que el personal no técnico la use en el sitio.Además, la compatibilidad del ADN aislado con LAMP, un método muy adecuado para el análisis de ácidos nucleicos en el punto de atención, demuestra aún más los requisitos mínimos de equipo y la idoneidad para los ensayos colorimétricos (Fig. 2b).
Los métodos de perlas magnéticas ofrecen la posibilidad de extracción automatizada, algunos de los cuales existen en extractores de ácido nucleico automatizados comerciales [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, EE. UU.), QIAcube® HT;CapitalBio (Pekín, China) y Biomek®;Beckman (Miami, Estados Unidos).), Florida, EE. UU.)].Las ventajas de combinar perlas magnéticas con microfluidos se pueden utilizar para la extracción automatizada eficiente de ácidos nucleicos, lo que potencialmente podría avanzar en el desarrollo de diagnósticos moleculares;sin embargo, la combinación de perlas magnéticas con microfluídica aún depende en gran medida de sistemas de control complejos para la manipulación precisa de perlas magnéticas, lo que explica la popularidad de los productos comerciales que son voluminosos y caros, lo que limita la aplicación adicional de perlas magnéticas en POCT.
Varios materiales porosos, como filtros de nitrocelulosa modificados, tarjetas de Finders Technology Associates (FTA), papeles de filtro a base de polietersulfona y materiales recubiertos de glicano también se han utilizado para la detección de ácidos nucleicos [40, 41, 42, 43, 44].Los materiales fibrosos porosos, como el papel fibroso, se utilizaron por primera vez para aislar el ADN entrelazando físicamente moléculas de ADN de cadena larga con fibras.Los poros pequeños conducen a una fuerte restricción física de las moléculas de ADN, lo que afecta positivamente la extracción de ADN.Debido a los diferentes tamaños de poro del papel fibroso, la eficiencia de extracción no puede satisfacer las necesidades de amplificación de ADN [45, 46].La tarjeta FTA es un papel de filtro comercial utilizado en el campo de la medicina forense y ampliamente utilizado en otras áreas del diagnóstico molecular.Mediante el uso de papel de filtro de celulosa impregnado con varios productos químicos para lisar las membranas celulares de la muestra, el ADN liberado se protege de la degradación hasta por 2 años.Más recientemente, se ha desarrollado papel de celulosa impregnada para la detección molecular de varios patógenos, incluidos el SARS-CoV-2, la leishmaniasis y la malaria [47,48,49].El VIH en el plasma aislado se lisa directamente y el ácido nucleico viral se enriquece en la membrana de flujo FTA® integrada en el concentrador, lo que permite una producción eficiente del ácido nucleico [50] (Fig. 2c).El principal problema de la detección de ácidos nucleicos mediante tarjetas FTA es que los productos químicos como la guanidina y el isopropanol inhiben las reacciones de amplificación posteriores.Para resolver este problema, desarrollamos el papel de filtro modificado con quitosano Fusion 5, que combina las ventajas del entrelazado físico de las moléculas de ADN y el papel de filtro fibroso, y la adsorción electrostática del ADN en compuestos modificados con quitosano para lograr una extracción de ácido nucleico altamente eficiente. ..fibras de filtro [51] (Fig. 2d).Del mismo modo, Zhu et al.[52] demostraron un método de PCR modificado con quitosano basado en un sistema de microfluidos capilares in situ para el aislamiento y la detección rápidos del ARN del virus del Zika.Los ácidos nucleicos se pueden adsorber/desorber en un medio mixto de lisado/PCR, respectivamente, en función de la propiedad de interruptor de encendido/apagado del quitosano.encendido y apagado”, sensible al pH.
Como se mencionó anteriormente, estas estrategias combinan las ventajas de varios materiales en fase sólida y aumentan la eficiencia de la extracción de ácidos nucleicos en microfluidos.En aplicaciones prácticas, el uso de estos materiales en grandes cantidades no es económico, y el tratamiento superficial adecuado o la modificación superficial de materiales comunes con estos materiales también pueden preservar su función.Por lo tanto, se cree que la implementación de estas estrategias después de un estudio piloto puede reducir los costos.
Las pruebas de ácido nucleico en plataformas de microfluidos a menudo utilizan volúmenes de muestra pequeños (< 100 µl), por lo tanto, requieren la amplificación de los ácidos nucleicos objetivo con sondas específicas para convertirlos en una señal que sea conveniente para la detección posterior (óptica, eléctrica y magnética) [53, 54]. Las pruebas de ácido nucleico en plataformas de microfluidos a menudo utilizan volúmenes de muestra pequeños (< 100 µl), por lo tanto, requieren la amplificación de los ácidos nucleicos objetivo con sondas específicas para convertirlos en una señal que sea conveniente para la detección posterior (óptica, eléctrica y magnética) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Cuando se analizan ácidos nucleicos en plataformas de microfluidos, a menudo se utilizan volúmenes de muestra pequeños (<100 µL), por lo que se requiere la amplificación de los ácidos nucleicos objetivo con sondas especiales para convertirlos en una señal conveniente para la detección posterior (óptica, eléctrica y magnética) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 为 便于 检测 （光学 、 电学 和 磁学） 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. La detección de ácidos nucleicos en plataformas microfluídicas suele utilizar volúmenes de muestra pequeños (<100 μl), lo que requiere la amplificación de los ácidos nucleicos diana con sondas especiales para convertirlos en señales para la detección posterior (óptica, eléctrica y magnética) [53, 54]] .La amplificación de ácidos nucleicos en microfluidos también puede acelerar las reacciones, optimizar los límites de detección, reducir los requisitos de muestra y mejorar la precisión de la detección [55, 56].En los últimos años, con la realización de una detección rápida y precisa, se han aplicado varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos en microfluidos, incluida la PCR y algunas reacciones de amplificación isotérmica.Esta sección resumirá los métodos para la detección de ácidos nucleicos basados ​​en sistemas de microfluidos.
La PCR es una simulación del proceso de replicación del ADN de un organismo, cuya teoría se describe en detalle en otra parte y no se discutirá aquí.La PCR puede amplificar una cantidad muy pequeña de ADN/ARN diana a un ritmo exponencial, lo que convierte a la PCR en una poderosa herramienta para la detección rápida de ácidos nucleicos.En las últimas décadas, se han desarrollado muchos dispositivos microfluídicos portátiles equipados con sistemas de ciclos térmicos de PCR para satisfacer las necesidades de diagnóstico en el punto de atención [57, 58].La PCR en chip se puede dividir en cuatro tipos (convencional, de flujo continuo, con conmutación espacial y PCR convectiva) de acuerdo con los diferentes métodos de control de temperatura [59].Por ejemplo, Gee et al.[60] desarrollaron un método de PCR cuantitativa de transcripción inversa directa (RT-qPCR) en su propia plataforma de microfluidos para la detección múltiple de SARS-CoV-2, virus de la influenza A y B en muestras de frotis de garganta (Fig. 3a) .Parque et al.[61] construyó un chip simple de análisis de patógenos mediante la integración de PCR de película delgada, electrodos y un módulo de microfluidos basado en polidimetilsiloxano operado con los dedos.Sin embargo, ambos trabajos encarnan las deficiencias comunes de la PCR convencional.La PCR requiere ciclos térmicos, lo que limita una mayor miniaturización del dispositivo y reduce el tiempo de prueba.
El desarrollo de microfluidos basados ​​en flujo continuo y PCR de espacio conmutado es fundamental para abordar este problema.Usando un canal serpenteante largo o un canal recto corto, la PCR de flujo continuo puede proporcionar una amplificación rápida mediante la circulación activa de reactivos en tres zonas de precalentamiento con una bomba fuera del chip.Esta operación evita con éxito la fase de transición entre diferentes temperaturas de reacción y, por lo tanto, reduce significativamente el tiempo de prueba [62] (Fig. 3b).En otro estudio de Jung et al.[63] propusieron un nuevo analizador genético de PCR rotatorio que combina las características de la PCR fija y de flujo para la PCR de transcripción inversa ultrarrápida y multiplex (Fig. 3c).Para la amplificación de ácidos nucleicos, el microchip de PCR se rotará a través de tres bloques de calentamiento a diferentes temperaturas: 1. Bloque de desnaturalización a 94 °C, 2. Bloque de hibridación a 58 °C, 3. Bloque de expansión a 72 °C.
Aplicación de la PCR en microfluídica.Representación esquemática de dirRT-qPCR en una plataforma de microfluidos (adaptado de [60]).b Representación esquemática de un microarreglo de PCR de flujo continuo basado en un canal serpenteante (adaptado de [62]).c Representación esquemática de un analizador genético rotatorio de PCR, que consta de un microchip, tres bloques de calentamiento y un motor paso a paso (adaptado de [63]).d Diagrama de PCR por termoconvección con centrifugación y configuración (adaptado de [64]).DirRT-qPCR, reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa directa
Usando capilares y bucles o incluso placas delgadas, la PCR por convección puede amplificar rápidamente los ácidos nucleicos por convección térmica libre natural sin necesidad de una bomba externa.Por ejemplo, se desarrolló una plataforma microfluídica de polímero de olefina cíclica en una etapa de calentamiento giratoria fabricada que utiliza ciclos térmicos con centrifugación en un microcanal de bucle de PCR [64] (Fig. 3d).La solución de reacción es impulsada por convección térmica, que intercambia continuamente alta y baja temperatura en un microcanal con estructura anular.Todo el proceso de amplificación se puede completar en 10 minutos con un límite de detección de 70,5 pg/canal.
Como era de esperar, la PCR rápida es una herramienta poderosa para sistemas de análisis multiplex y diagnóstico molecular de respuesta de muestra totalmente integrados.La PCR rápida reduce significativamente el tiempo requerido para detectar el SARS-CoV-2, lo que contribuye al control efectivo de la pandemia de COVID-19.
PCR requiere un termociclador complejo que no es adecuado para POCT.Más recientemente, se han aplicado técnicas de amplificación isotérmica a la microfluídica, incluidas, entre otras, LAMP, amplificación de polimerasa de recombinasa (RPA) y amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos [65,66,67,68].Con estas técnicas, los ácidos nucleicos se amplifican a una temperatura constante, lo que facilita la creación de dispositivos POCT portátiles altamente sensibles y de bajo costo para el diagnóstico molecular.
Los ensayos LAMP basados ​​en microfluidos de alto rendimiento permiten la detección múltiple de enfermedades infecciosas [42, 69, 70, 71].En combinación con un sistema microfluídico centrífugo, LAMP puede facilitar aún más la automatización de la detección de ácidos nucleicos [69, 72, 73, 74, 75].El SlipChip de girar y reaccionar se desarrolló para la detección visual de múltiples bacterias paralelas usando LAMP [76] (Fig. 4a).Cuando se usó LAMP optimizada en el ensayo, la relación señal-ruido de fluorescencia fue de aproximadamente 5 veces y el límite de detección alcanzó las 7,2 copias/μl de ADN genómico. Además, se visualizó la existencia de cinco patógenos bacterianos digestivos comunes, incluidos Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis y Vibrio parahaemolyticus, según el método en < 60 min. Además, se visualizó la existencia de cinco patógenos bacterianos digestivos comunes, incluidos Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis y Vibrio parahaemolyticus, según el método en < 60 min.Además, la presencia de cinco patógenos bacterianos comunes del tracto digestivo, incluidos Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis y Vibrio parahaemolyticus, se visualizó utilizando este método en menos de 60 minutos.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 弧菌。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 eléctrica此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 、 弧菌 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 eléctrica HIPAdemás, la presencia de cinco patógenos gastrointestinales bacterianos comunes, incluidos Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius y Vibrio parahaemolyticus, se visualizó utilizando este método en menos de 60 minutos.
Las ventajas de LAMP en microfluídica incluyen, entre otras, respuesta rápida y detección miniaturizada.Sin embargo, debido a la temperatura de reacción (alrededor de 70 °C), inevitablemente se generan aerosoles durante LAMP, lo que da como resultado una alta tasa de falsos positivos.La especificidad del ensayo, el diseño del cebador y el control de la temperatura también deben optimizarse para LAMP.Además, los diseños de chips que implementan la detección de objetivos múltiples en un solo chip son de gran valor y deben desarrollarse.Además, LAMP es adecuado para la detección multipropósito integrado en un chip, lo cual es de gran importancia, pero todavía hay mucho espacio para el desarrollo.
La alta tasa de falsos positivos de LAMP se puede reducir en parte con RPA, ya que la temperatura de reacción relativamente baja (~37 °C) genera relativamente pocos problemas de evaporación [77].En el sistema RPA, dos cebadores opuestos inician la síntesis de ADN uniéndose a una recombinasa y la amplificación puede completarse en 10 minutos [78,79,80,81].Por lo tanto, todo el proceso RPA es mucho más rápido que PCR o LAMP.En los últimos años, se ha demostrado que la tecnología de microfluidos mejora aún más la velocidad y la precisión de RPA [82,83,84].Por ejemplo, Liu et al.[85] desarrolló un ensayo de amplificación de recombinasa de polimerasa de flujo lateral integrado microfluídico para la detección rápida y sensible del SARS-CoV-2 mediante la integración de RPA de transcripción inversa (RT-RPA) y un sistema universal de detección de tiras reactivas de flujo lateral.en un único sistema de microfluidos.Figura 4b).El límite de detección es de 1 copia/µl o 30 copias/muestra, y la detección puede completarse en unos 30 minutos.Kong et al.han desarrollado un dispositivo microfluídico portátil.[86] utilizaron la temperatura corporal y un sistema de detección de fluorescencia basado en teléfonos móviles para detectar rápida y directamente el ADN del VIH-1 mediante RPA (Figura 4c).El ensayo RPA portátil detecta 100 copias/mL de la secuencia objetivo en 24 minutos, lo que demuestra un gran potencial para el diagnóstico rápido de bebés infectados con VIH-1 en entornos con recursos limitados.
Amplificación isotérmica en pruebas en el punto de atención (POCT).Desarrollo y producción de SpinChip y reacción SlipChip.Después de la soldadura por plasma, las virutas superior e inferior se ensamblaron con un juego de tuercas para formar la viruta final (adaptado de [76]).b Esquema del sistema MI-IF-RPA para la detección de COVID-19 (adaptado de [85]).c Esquema de una prueba RPA portátil para la detección rápida del ADN del VIH-1 (adaptado de [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxifluoresceína, virus de la inmunodeficiencia humana VIH, amplificación de polimerasa de recombinasa RPA, diodo emisor de luz LED, recombinasa- polimerasa de flujo lateral integrada de microfluidos MI-IF-RPA Amplificación
La RPA basada en microfluidos se está desarrollando rápidamente, sin embargo, el costo de fabricación de chips y el consumo de reacción es demasiado alto y debe reducirse para aumentar la disponibilidad de esta tecnología.Además, la alta sensibilidad de RPA puede afectar la amplificación de productos no específicos, especialmente en presencia de contaminación.Estas limitaciones pueden afectar la aplicación de RPA en sistemas de microfluidos y merecen una mayor optimización.También se necesitan cebadores y sondas bien diseñados para varios objetivos para mejorar la viabilidad de las estrategias microfluídicas basadas en RPA en POCT.
Cas13 y Cas12a tienen la capacidad de escindir aleatoriamente ácidos nucleicos y, por lo tanto, pueden desarrollarse como herramientas de detección y diagnóstico.Cas13 y Cas12a se activan al unirse al ADN o ARN objetivo, respectivamente.Una vez activada, la proteína comienza a escindir otros ácidos nucleicos cercanos, después de lo cual los ARN guía que se dirigen a los ácidos nucleicos específicos de patógenos pueden escindir las sondas fluorescentes apagadas y liberar fluorescencia.Con base en esta teoría, Kellner et al.[87] desarrollaron un método basado en Cas13 [Desbloqueo de informador enzimático específico de alta sensibilidad (SHERLOCK)], y Broughton et al.[88] desarrolló otro enfoque basado en Cas12a [CRISPR Trans Reporter dirigido a la endonucleasa de ADN (DTECR)].
En los últimos años han aparecido diversos métodos para la detección de ácidos nucleicos basados ​​en CRISPR [89, 90].Los métodos convencionales basados ​​en CRISPR a menudo requieren mucho tiempo y mano de obra debido a múltiples procedimientos que incluyen la extracción de ácido nucleico, la amplificación y la detección CRISPR.La exposición de líquidos al aire puede aumentar la posibilidad de resultados falsos positivos.Teniendo en cuenta lo anterior, los sistemas basados ​​en CRISPR necesitan urgentemente una optimización.
Se ha desarrollado una plataforma microfluídica controlada neumáticamente que puede realizar 24 análisis en paralelo para aplicaciones de detección CRISPR-Cas12a y CRISPR-Cas13a [91].El sistema está equipado con un dispositivo de detección de fluorescencia que evita la amplificación de ácido nucleico y detecta automáticamente muestras de ADN y ARN femtomolar.Chen et al.[92] amplificación de recombinasa integrada con el sistema CRISPR-Cas12a en microfluidos centrífugos (Fig. 5a).Este trabajo supera la dificultad de integrar estos dos procesos porque Cas12a puede digerir el ADN mensajero e inhibir el proceso de amplificación.Además, Chen et al.[92] además almacenó previamente los reactivos de reacción en un control microfluídico centrífugo para completar automáticamente todo el proceso.En otro trabajo, Silva et al.[93] desarrollaron un método de diagnóstico sin amplificación CRISPR/Cas12a y un teléfono inteligente para detectar el SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Este ensayo, conocido como un sistema sin amplificación basado en teléfonos celulares, incluye una enzima dependiente de CRISPR/Cas que se basa en la visualización de señales de burbujas generadas por catalasa en canales de microfluidos mediante teléfonos inteligentes.Detección sensible de menos de 50 copias/µl de ácido nucleico sin preamplificación, todo el proceso desde la inyección de la muestra hasta la lectura de la señal tarda solo 71 minutos.
Métodos de detección de ácidos nucleicos basados ​​en CRISPR.POCT centrífugo para diagnóstico molecular integrado basado en CRISPR (adaptado de [92]).b Desarrollo de la prueba CASCADE para el análisis de SARS-CoV-2 basado en teléfonos inteligentes (adaptado de [93]).Amplificación de recombinasa RAA, motivo protoespaciador adyacente PAM, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas CRISPR a intervalos regulares, sistema CASCADE sin amplificación de teléfono celular con enzimas dependientes de CRISPR/CAS, clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida EDC
Como último paso en la detección de ácidos nucleicos, la detección de señales refleja directamente los resultados del diagnóstico y es un factor crítico en el desarrollo de una POCT eficiente, sensible y precisa.Las señales se pueden leer utilizando varios métodos, como estrategias fluorescentes, electroquímicas, colorimétricas y magnéticas.En esta sección, describimos la justificación de cada enfoque y comparamos el diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas en microfluidos.
Las estrategias basadas en fluorescencia se utilizan ampliamente para el diagnóstico POCT de enfermedades infecciosas debido a sus notables ventajas de excelente sensibilidad, bajo costo, facilidad de operación y análisis en el punto de atención [94, 95].Estas estrategias utilizan fluoróforos marcados, como tintes fluorescentes y nanomateriales, para crear una señal detectable (mejora o atenuación de la fluorescencia).Este hallazgo sugiere que las estrategias basadas en la fluorescencia se pueden dividir en marcaje fluorescente directo, detección fluorescente con señal activada y señal apagada [96].La detección directa de etiquetas fluorescentes utiliza etiquetas fluorescentes especiales para etiquetar ligandos específicos que generan una cantidad específica de fluorescencia cuando se unen selectivamente a un objetivo.Para la detección de fluorescencia basada en señales, la calidad de la señal fluorescente se relaciona positivamente con la magnitud de interés.La intensidad de la fluorescencia es insignificante en ausencia de un objetivo y es detectable cuando está presente una cantidad suficiente de objetivo.Por el contrario, la intensidad de la fluorescencia detectada por la fluorescencia de "señal de apagado" es inversamente proporcional a la cantidad de objetivo, alcanzando inicialmente un valor máximo y disminuyendo gradualmente a medida que se amplía el objetivo.Por ejemplo, utilizando el mecanismo de escisión en trans dependiente del objetivo CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] desarrolló una nueva estrategia de reconocimiento para detectar ARN que eluden la transcripción inversa directamente (Fig. 6a).Al unirse a los ARN diana complementarios, el complejo CRISPR-Cas13-ARN puede activarse, lo que desencadena la escisión transcolateral por parte de los ARN indicadores no específicos.El reportero marcado con fluorescencia [fluoróforo (F)] es extinguido por el extintor (Q) intacto y emite fluorescencia cuando es escindido por el complejo activado.
La ventaja de la detección electroquímica es la alta velocidad de detección, fácil producción, bajo costo, fácil de transportar y control automático.Es un poderoso método analítico para aplicaciones POCT.Basado en transistores de efecto de campo de grafeno, Gao et al.[98] desarrollaron un nanobiosensor para la detección múltiplex de antígenos de la enfermedad de Lyme de la bacteria Borrelia burgdorferi con un límite de detección de 2 pg/mL (Fig. 6b).
Los ensayos colorimétricos se han utilizado en aplicaciones POCT, beneficiándose de las ventajas de portabilidad, bajo costo, facilidad de preparación y lectura visual.La detección colorimétrica puede usar la oxidación de peroxidasa o nanomateriales similares a la peroxidasa, la agregación de nanomateriales y la adición de tintes indicadores para convertir la información sobre la presencia de ácidos nucleicos objetivo en cambios de color visibles [99, 100, 101].En particular, las nanopartículas de oro se utilizan ampliamente en el desarrollo de estrategias colorimétricas y, debido a su capacidad para inducir cambios de color rápidos y significativos, existe un interés creciente en el desarrollo de plataformas colorimétricas POCT para el diagnóstico in situ de enfermedades infecciosas [102].Con un dispositivo microfluídico centrífugo integrado [103], los patógenos transmitidos por los alimentos en muestras de leche contaminada se pueden detectar automáticamente al nivel de 10 células bacterianas, y los resultados se pueden leer visualmente en 65 minutos (Fig. 6c).
Las técnicas de detección magnética pueden detectar analitos con precisión utilizando materiales magnéticos, y ha habido un gran interés en las aplicaciones POCT en las últimas décadas.Las técnicas de detección magnética tienen algunas ventajas únicas, como materiales magnéticos de bajo costo en lugar de componentes ópticos costosos.Sin embargo, el uso de un campo magnético mejora la eficiencia de detección y reduce el tiempo de preparación de la muestra [104].Además, los resultados del sondeo magnético demuestran una alta especificidad, sensibilidad y una alta relación señal/ruido debido a la insignificante señal magnética de fondo de las muestras biológicas [105].Sharma et al.integró un biosensor basado en unión de túnel magnético en una plataforma de microchip portátil.[106] para detección multiplex de patógenos (Fig. 6d).Los biosensores detectan con sensibilidad los ácidos nucleicos subnanomolares aislados de patógenos.
Método típico de detección de señales.El concepto de detección hiperlocalizada de Cas13a (adaptado de [97]).b Nanobiosensor de grafeno FET en combinación con Lyme GroES scFv (adaptado de [98]).c Indicaciones colorimétricas para la detección multiplex de patógenos transmitidos por los alimentos en un chip microfluídico centrífugo: muestras n.º 1 y n.º 3 con patógenos objetivo, y muestras n.º 2, n.º 4 y n.º 5 sin patógenos objetivo (adaptado de [103]) .d Biosensor basado en una unión de túnel magnético, que incluye una plataforma, un amplificador de bloqueo incorporado, una unidad de control y una fuente de alimentación para la generación/adquisición de señales (adaptado de [106]).GFET Grafeno FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimeticona, PMMA polimetil metacrilato
A pesar de las excelentes características de los métodos de detección anteriores, todavía tienen desventajas.Estos métodos se comparan (tabla 1), incluyendo algunas aplicaciones con detalles (pros y contras).
Con el desarrollo de la microfluídica, los sistemas microelectromecánicos, la nanotecnología y la ciencia de los materiales, el uso de chips microfluídicos para la detección de enfermedades infecciosas avanza constantemente [55,96,107,108].La manipulación precisa de equipos y fluidos en miniatura contribuye a la precisión diagnóstica y la rentabilidad.Por lo tanto, para un mayor desarrollo, se han realizado esfuerzos para optimizar y actualizar los chips, lo que ha dado como resultado varios chips microfluídicos con diferentes estructuras y funciones.Aquí presentamos brevemente varios tipos comunes de plataformas microfluídicas y comparamos sus características (pros y contras).Además, la mayoría de los ejemplos que se enumeran a continuación se centran principalmente en combatir el SARS-CoV-2.
Los LOCC son los sistemas analíticos complejos miniaturizados más comunes y sus operaciones están altamente miniaturizadas, integradas, automatizadas y paralelizadas desde la inyección y preparación de muestras, el control de flujo y la detección de líquidos [109, 110].Los líquidos se manipulan mediante una geometría cuidadosamente diseñada y la interacción de muchos efectos físicos, como gradientes de presión, acción capilar, electrodinámica, campos magnéticos y ondas acústicas [111].LOCC muestra excelentes ventajas en la detección de alto rendimiento y detección múltiple, con velocidad de análisis rápida, tamaño de muestra pequeño, bajo consumo de energía y alta eficiencia de gestión y operación;sin embargo, los dispositivos LOCC son muy delicados y se fabrican, empaquetan e interconectan.Sin embargo, la multiplexación y la reutilización se enfrentan a enormes dificultades [96].En comparación con otras plataformas, LOCC tiene ventajas únicas en términos de máxima diversidad de aplicaciones y mejor compatibilidad tecnológica, pero sus desventajas también son obvias, a saber, alta complejidad y mala repetibilidad.La dependencia de bombas externas, que suelen ser voluminosas y costosas, limita aún más su uso en POCT.
Durante el brote de COVID-19, LOCC recibió mucha atención.Al mismo tiempo, hay varios chips nuevos que combinan varias tecnologías.Por ejemplo, los teléfonos inteligentes ahora se usan ampliamente como dispositivos analíticos portátiles y tienen un gran potencial para la integración LOCC.sol et al.[21] fabricó un chip de microfluidos que permite multiplexar secuencias de ácido nucleico específicas de cinco patógenos, incluido el SARS-CoV-2, usando LAMP y las analizó usando un teléfono inteligente dentro de 1 hora después del final de la reacción.Como otro ejemplo, Sundah et al.[112] creó un interruptor molecular [amplificación catalítica por cambio de estado de transición molecular (CATCH)] para la detección directa y sensible de objetivos de ARN del SARS-CoV-2 utilizando teléfonos inteligentes. CATCH es compatible con LOCC portátil y logra un rendimiento superior (aproximadamente 8 copias de ARN/μl; < 1 hora a temperatura ambiente) [112]. CATCH es compatible con LOCC portátil y logra un rendimiento superior (aproximadamente 8 copias de ARN/μl; < 1 hora a temperatura ambiente) [112]. Catch свестиtimo сортативныíf locc и оеспечивает превосхianteдн производите razón CATCH es compatible con LOCC portátil y proporciona un rendimiento excelente (aproximadamente 8 copias de ARN/µl; < 1 hora a temperatura ambiente) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 ARN 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 ARN 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 Catch свестиtimo сортативныífor CATCH es compatible con LOCC portátiles y tiene un rendimiento excelente (aproximadamente 8 copias de ARN/µl; < 1 hora a temperatura ambiente) [112].Además, los dispositivos LOCC para el diagnóstico molecular también utilizan algunas fuerzas impulsoras como el vacío, el estiramiento y los campos eléctricos.Kang et al.[113] demostraron una PCR ultrarrápida de nanoplasma en un chip en tiempo real para el diagnóstico rápido y cuantitativo de COVID-19 en el campo utilizando un chip de PCR líquido plasmónico al vacío.Li et al.[114] posteriormente desarrolló un chip de microfluidos impulsado por estiramiento que permitió el diagnóstico de COVID-19.La plataforma utiliza el sistema de amplificación RT-LAMP para determinar si una muestra es cualitativamente positiva o negativa.Posteriormente, Ramachandran et al.[115] lograron gradientes de campo eléctrico apropiados mediante isotacoforesis (ITP), una técnica de enfoque selectivo de iones implementada en microfluídica.Con ITP, el ARN objetivo de las muestras de hisopos nasofaríngeos sin procesar se puede purificar automáticamente.Luego, Ramachandran et al.[115] Al combinar esta purificación de ITP con los ensayos LAMP y CRISPR mejorados con ITP, se detectó el SARS-CoV-2 en hisopos nasofaríngeos humanos y muestras clínicas en aproximadamente 35 minutos.Además, constantemente surgen nuevas ideas.Jadhav et al.[116] propusieron un esquema de diagnóstico basado en la espectroscopia Raman mejorada en la superficie en combinación con un dispositivo de microfluidos que contiene nanotubos de carbono recubiertos de oro/plata orientados verticalmente o micro/nanotubos electrohilados desechables.Los microcanales de filtro integrados funcionalizados con membrana son desechables.El dispositivo adsorbe virus de varios fluidos corporales/exudaciones como saliva, nasofaringe y lágrimas.Por lo tanto, el título del virus es abundante y el virus puede identificarse con precisión mediante la firma Raman.
LOAD es una plataforma microfluídica centrífuga en la que todos los procesos están controlados por un protocolo de frecuencia que rota un sustrato microestructurado [110].El dispositivo LOAD se caracteriza por utilizar la fuerza centrífuga como importante fuerza motriz.Los líquidos también están sujetos a fuerzas capilares, de Euler y de Coriolis.Usando un dispositivo centrífugo, los análisis se realizan en operación líquida continua desde una posición radial hacia adentro hacia afuera, eliminando la necesidad de tuberías, bombas, actuadores y válvulas activas externas adicionales.En resumen, un solo método de control simplifica la operación.Las fuerzas que actúan sobre el líquido en el mismo canal microfluídico a la misma distancia del centro de carga son iguales, lo que permite repetir la estructura del canal.Por lo tanto, el equipo LOAD es más simple y más económico de diseñar y fabricar que el equipo LOCC convencional, mientras que las reacciones son en gran medida independientes y paralelas;sin embargo, debido a la alta resistencia mecánica del equipo centrífugo, el material de astillas disponible es limitado y los volúmenes pequeños son difíciles.al coche.Al mismo tiempo, la mayoría de los dispositivos LOAD están diseñados para un solo uso, lo cual es costoso para la detección a gran escala [96, 117, 118, 119].
En las últimas décadas, LOAD, considerado uno de los dispositivos de microfluidos más prometedores, ha recibido una atención considerable por parte de investigadores y fabricantes.Por lo tanto, LOAD ha ganado una amplia aceptación y se ha utilizado para el diagnóstico molecular de patógenos infecciosos [120, 121, 122, 123, 124], especialmente durante el brote de COVID-19.Por ejemplo, a fines de 2020, Ji et al.[60] demostró un ensayo de RT-qPCR directo para la detección paralela rápida y automatizada de infecciones por SARS-CoV-2 e influenza A y B en muestras de hisopado faríngeo.Luego, Xiong et al.[74] presentó una plataforma microfluídica discoide integrada en LAMP para la detección rápida, precisa y simultánea de siete coronavirus respiratorios humanos, incluido el SARS-CoV-2, en 40 minutos.A principios de 2021, de Oliveira et al.[73] demostró un chip microfluídico centrífugo de tóner de poliestireno, operado manualmente con un rotador en la yema del dedo, para el diagnóstico molecular RT-LAMP de COVID-19.Posteriormente, Dignan et al.[39] presentó un microdispositivo de centrífuga portátil automatizado para la purificación del ARN del SARS-CoV-2 directamente a partir de secciones de hisopos bucales.Medved et al.[53] propusieron un sistema de muestreo de aerosoles SARS-CoV-2 en línea con un chip fluorescente microfluídico giratorio de pequeño volumen con un límite de detección de 10 copias/μL y un umbral de ciclo mínimo de 15 minutos.Suárez et al.[75] informaron recientemente sobre el desarrollo de una plataforma microfluídica centrífuga modular integrada para la detección directa de ARN del SARS-CoV-2 en muestras de hisopos nasofaríngeos inactivados por calor utilizando LAMP.Estos ejemplos demuestran los grandes beneficios y la promesa de LOAD en el diagnóstico molecular de COVID-19.
En 1945, Muller y Clegg [125] presentaron por primera vez canales microfluídicos en papel utilizando papel de filtro y parafina.En 2007, el grupo de Whitesides [126] creó la primera plataforma funcional en papel para pruebas de glucosa y proteínas.El papel se ha convertido en un sustrato ideal para la microfluídica.El papel tiene propiedades inherentes como hidrofilia y estructura porosa, excelente biocompatibilidad, peso ligero, flexibilidad, capacidad de plegado, bajo costo, facilidad de uso y conveniencia.Los µPAD clásicos consisten en estructuras hidrofílicas/hidrofóbicas construidas sobre sustratos de papel.Dependiendo de la estructura tridimensional, los μPAD se pueden dividir en μPAD bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D).Los µPAD 2D se producen mediante la formación de límites hidrofóbicos para formar canales microfluídicos, mientras que los µPAD 3D generalmente se fabrican a partir de pilas de capas de papel microfluídico 2D, a veces mediante plegado de papel, técnicas de deslizamiento, canales abiertos e impresión 3D [96].Los fluidos biológicos o acuosos en el μPAD se controlan principalmente mediante la fuerza capilar sin una fuente de alimentación externa, lo que facilita el almacenamiento previo de reactivos, la manipulación de muestras y la detección multiplex.Sin embargo, el control de flujo preciso y la detección multiplex se ven obstaculizados por una velocidad de detección, sensibilidad y reutilización insuficientes [96, 127, 128, 129, 130].
Como plataforma microfluídica inusual, μPAD se ha promocionado y desarrollado ampliamente para el diagnóstico molecular de enfermedades infecciosas como el VHC, el VIH y el SARS-CoV-2 [131, 132].Para la detección selectiva y sensible del VHC, Tengam et al.[133] desarrollaron un nuevo biosensor basado en papel fluorescente usando una sonda de ácido nucleico altamente específica basada en péptido de pirrolidinilo.Los ácidos nucleicos se inmovilizan covalentemente en papel de celulosa parcialmente oxidada mediante alquilación reductora entre grupos amino y grupos aldehído, y la detección se basa en la fluorescencia.Estas señales pueden ser leídas por un dispositivo especialmente diseñado con una cámara fluorescente portátil en combinación con la cámara de un teléfono celular.Posteriormente, Lu et al.[134] diseñó un electrodo flexible basado en papel basado en compuestos de estructura organometálica de níquel/nanopartículas de oro/nanotubos de carbono/alcohol polivinílico para la detección de objetivos de VIH mediante hibridación de ADN usando azul de metileno como indicador redox de ADN.Más recientemente, Chowdury et al.[135] presentó un diseño de plataforma hipotética para la prueba de µPAD en el punto de atención utilizando saliva cruda del paciente en combinación con LAMP y tecnología de imagen portátil para la detección de analitos de COVID-19.
Las pruebas de flujo lateral guían los fluidos por fuerzas capilares y controlan el movimiento de fluidos por la humectabilidad y las características de los sustratos porosos o microestructurados.Los dispositivos de flujo lateral constan de muestra, conjugado, incubadora y detección, y almohadillas absorbentes.Las moléculas de ácido nucleico en el LFA reconocen aglutinantes específicos que se almacenan previamente en el sitio de unión y se unen como complejos.A medida que el líquido pasa a través de las placas de incubación y detección, los complejos son capturados por las moléculas de captura ubicadas en las líneas de prueba y control, mostrando resultados que se pueden leer directamente a simple vista.Por lo general, LFA se puede completar en 2 a 15 minutos, que es más rápido que el descubrimiento tradicional.Debido al mecanismo especial, LFA requiere pocas operaciones y no requiere equipo adicional, lo que lo hace muy fácil de usar.Es fácil de fabricar y miniaturizar, y el costo de los sustratos a base de papel es menor.Sin embargo, solo se usa para análisis cualitativos, y la detección cuantitativa es muy difícil, y la capacidad de multiplexación y el rendimiento son muy limitados, y solo se puede detectar un ácido nucleico suficiente a la vez [96,110,127].
Aunque la mayoría de las aplicaciones de LFA se centran en los inmunoensayos, el uso de LFA para el diagnóstico molecular en chips de microfluidos también es eficaz y popular [136].En el caso del virus de la hepatitis B, VIH y SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] propusieron una plataforma LFA de nanopartículas de conversión ascendente y demostraron la versatilidad de esta plataforma miniaturizada y portátil a través de la detección sensible y cuantitativa de múltiples objetivos, como el ácido nucleico del VHB.Además, Fu et al.[138] demostró un nuevo LFA basado en la espectroscopia Raman mejorada en superficie para el análisis cuantitativo del ADN del VIH-1 en bajas concentraciones.Para una detección rápida y sensible del SARS-CoV-2, Liu et al.[85] desarrolló un análisis de flujo lateral RPA integrado con microfluidos mediante la combinación de RT-RPA y un sistema universal de detección de flujo lateral en un solo sistema microfluídico.
La aplicación de varias plataformas microfluídicas varía según los estudios específicos, aprovechando al máximo las capacidades y ventajas de las plataformas.Con válvulas, bombas y conductos asequibles, LOCC es la plataforma más completa para la diversidad de aplicaciones y la interoperabilidad con el mayor espacio para el desarrollo.Por lo tanto, esperamos y recomendamos que los estudios más recientes se realicen en LOCC como un primer intento y que se optimicen las condiciones.Además, se espera descubrir y utilizar métodos más eficientes y precisos en el sistema.LOAD sobresale en el control preciso de fluidos de los dispositivos LOCC existentes y demuestra ventajas únicas en accionamientos individuales por fuerza centrífuga sin necesidad de accionamientos externos, mientras que las respuestas paralelas pueden separarse y sincronizarse.Así, en el futuro, LOAD se convertirá en la principal plataforma de microfluidos con menos operaciones manuales y tecnologías más maduras y automatizadas.La plataforma µPAD combina los beneficios de LOCC y los materiales basados ​​en papel para diagnósticos de bajo costo y de un solo uso.Por lo tanto, el desarrollo futuro debe centrarse en tecnologías convenientes y bien establecidas.Además, el LFA es muy adecuado para la detección a simple vista, lo que promete reducir el consumo de muestras y acelerar la detección.En la Tabla 2 se muestra una comparación detallada de plataformas.
Los análisis digitales dividen la muestra en muchos microrreactores, cada uno de los cuales contiene un número discreto de moléculas diana [139, 140].Los ensayos digitales ofrecen ventajas significativas para realizar la cuantificación absoluta al realizar miles de experimentos bioquímicos paralelos de manera simultánea e individual en compartimentos a escala micrométrica en lugar de en una fase continua.En comparación con la microfluídica tradicional, las reacciones compartimentales pueden reducir el volumen de la muestra, aumentar la eficiencia de la reacción e integrarse fácilmente con otros métodos analíticos sin necesidad de canales, bombas, válvulas y diseños compactos [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Los siguientes dos métodos se utilizan en ensayos digitales para lograr una separación uniforme y precisa de soluciones, incluidos reactivos y muestras como células, ácidos nucleicos y otras partículas o moléculas: (1) gotas de emulsiones que explotan la inestabilidad de la interfaz líquida;(2) la división de la matriz se lleva a cabo por las restricciones geométricas del dispositivo.En el primer método, las gotas que contienen reactivos y muestras en microcanales pueden crearse mediante métodos pasivos como co-corriente, flujo cruzado, enfoque de flujo, emulsificación por etapas, emulsificación de microcanales y membranas a través de fuerzas de corte viscoso y emulsificación con cambio de canal.localización [143, 145, 146, 148, 149] o usando métodos activos [150, 151], que introducen energía adicional a través del control eléctrico, magnético, térmico y mecánico.En el último enfoque, la mejor uniformidad del volumen de fluido en cámaras microfluídicas se comparte manteniendo estructuras espaciales del mismo tamaño, como micropozos y arreglos de superficie [152,153,154].En particular, las gotas son las principales secciones de flujo que también se pueden generar y manipular en conjuntos de electrodos basados ​​en microfluidos digitales (DMF).La electrohumectación de dieléctricos es una de las teorías DMF mejor estudiadas, ya que la electrohumectación de dieléctricos permite la manipulación precisa de gotas individuales, controlando la forma del líquido y las señales eléctricas asimétricas que pasan por diferentes lados [141, 144].Las principales operaciones con gotas en DMF incluyen la clasificación, división y fusión [151, 155, 156], que se pueden aplicar en varios campos de análisis, especialmente en detección molecular [157, 158, 159].
La detección digital de ácidos nucleicos es una tecnología de diagnóstico molecular de tercera generación que sigue la PCR convencional y la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), en paralelo con la secuenciación de alto rendimiento y la biopsia líquida.En las últimas dos décadas, los ácidos nucleicos digitales se han desarrollado rápidamente en el campo del diagnóstico molecular de patógenos infecciosos [160, 161, 162].La cuantificación absoluta de la detección digital de ácidos nucleicos comienza con el empaquetado de muestras y reactivos en compartimentos individuales para garantizar que cada secuencia objetivo tenga la misma probabilidad de entrar en cada compartimento individual.Teóricamente, a cada sección se le pueden asignar múltiples secuencias objetivo, o puede que no haya un sistema de microrreacción independiente.A través de los diversos mecanismos de detección descritos anteriormente, los compartimentos con secuencias diana microbianas que generan señales por encima de un cierto umbral se pueden visualizar a simple vista o mediante una máquina y se etiquetan como positivos, mientras que otros compartimentos que generan señales por debajo del umbral se etiquetan como positivos. .negativos, que hacen que la señal de cada sección sea booleana.Por lo tanto, al calcular el número de compartimentos creados y la tasa de resultados positivos después de la reacción, las copias originales de las muestras de prueba se pueden comparar utilizando la fórmula de distribución de Poisson sin necesidad de una curva estándar, que se requiere para los análisis cuantitativos de rutina como como qPCR.[163] En comparación con los métodos de diagnóstico molecular tradicionales, la detección digital de ácidos nucleicos tiene un mayor grado de automatización, mayor velocidad y sensibilidad de análisis, menos reactivos, menos contaminación y un diseño y fabricación más sencillos.Por estas razones, el uso de ensayos digitales, especialmente métodos basados ​​en gotas, para el diagnóstico molecular, combinando técnicas de amplificación y lectura de señales, ha sido bien estudiado durante el brote crítico de SARS-CoV-2.Por ejemplo, Yin et al.[164] combinaron métodos de PCR rápidos y digitales de gotitas para detectar los genes ORF1ab, N y RNasa P en el SARS-CoV-2 en un chip microfluídico.En particular, el sistema pudo identificar una señal positiva en 115 segundos, que es más rápido que la PCR convencional, lo que indica su eficacia en la detección en el punto de atención (Figura 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] y Alteri et al.[167] también aplicó la PCR digital de gotas (ddPCR) para detectar el SARS-CoV-2 en un sistema de microfluidos con resultados impresionantes.Para mejorar aún más la tasa de detección, Shen et al.[168] logró imágenes de chip basadas en ddPCR en tan solo 15 s sin el uso de técnicas de unión de imágenes, lo que aceleró el proceso de la tecnología ddPCR desde el laboratorio hasta la aplicación.No solo se aplican métodos de amplificación térmica como PCR, sino que también se utilizan métodos de amplificación isotérmica para simplificar las condiciones de reacción y una respuesta rápida.Lu et al.[71] desarrolló SlipChip para el análisis de gotitas, capaz de generar gotitas de varios tamaños a altas densidades en un solo paso y cuantificar los ácidos nucleicos del SARS-CoV-2 usando LAMP digital (Figura 7b).Como tecnología en rápida evolución, CRISPR también puede desempeñar un papel importante en la detección digital de ácidos nucleicos a través de imágenes colorimétricas convenientes sin necesidad de tinciones adicionales de ácidos nucleicos.Ackermann et al.desarrolló una matriz de reacción combinatoria para la evaluación múltiplex de ácidos nucleicos.[158] detectaron 169 virus asociados con humanos, incluido el SARS-CoV-2, en gotitas que contenían reactivos de detección de ácido nucleico basados ​​en CRISPR-Cas13 en un ensayo de micropocillos (Figura 7c).Además, la amplificación isotérmica y la tecnología CRISPR se pueden utilizar en el mismo sistema para combinar los beneficios de ambos.Parque et al.[169] Se desarrolló un ensayo digital CRISPR/Cas12a en un chip microfluídico comercial para la detección de SARS-CoV-2 extraído y eliminado por calor basado en un RT-RPA de etapa única con una detección de señal a fondo más corta y más alta relación de tiempo, rango dinámico más amplio y mejor sensibilidad (Fig. 7d).Algunas descripciones de estos ejemplos se dan en la Tabla 3.
Plataforma digital típica para la detección de ácidos nucleicos.a El flujo de trabajo de la PCR digital rápida consta de cuatro pasos clave: preparación de la muestra, distribución de la mezcla de reacción, proceso de amplificación y cuantificación del objetivo (adaptado de [164]).b Esquema que muestra el análisis de gotas SlipChip para la formación de gotas a alta densidad (adaptado de [71]).c Diagrama de flujo de trabajo CARMEN-Cas13 (adaptado de [158]).d Descripción general de la detección digital avanzada de virus con CRISPR/Cas en un solo recipiente (adaptado de [169]).W/O agua en aceite, polidimetilsiloxano PDMS, reacción en cadena de la polimerasa PCR, recopilación de datos DAQ, derivada integral proporcional PID, reacción de matriz combinatoria CARMEN para evaluación múltiple de ácidos nucleicos, SARS-CoV-2, síndrome respiratorio agudo severo, coronavirus 2, RT Amplificación de la transcriptasa inversa recombinasa polimerasa-RPA, señal S/B en segundo plano

Hora de publicación: 15-sep-2022